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研究背景与目的
吲哚化合物存在于很多植物中，特别是十字花科蔬菜，例如:西蓝花、卷心菜、花椰菜，而食用十字花科蔬菜有助于抵抗癌症，导致许多癌症发病率的降低，例如前列腺癌，肺癌，乳腺癌和结直肠癌。癌症作为严重威胁人类健康的疾病之一，近年来随着生活节奏的加快，其发生率也逐渐上升。每年全球因癌症死亡的人数多达820万，据世界卫生组织报告，到2030年，患癌人数将达到2360万。已有研究表明，吲哚类化合物，在抗肿瘤方面表现出的良好生物活性，通常通过调节细胞周期，诱导凋亡，抑制血管生成和抑制细胞侵袭发挥抗癌作用。目前已经开发了多种吲哚类抗肿瘤药物应用于临床。在本论文中，我们通过筛选一系列吲哚化合物，发现抗癌效果较好的化合物3ab。在药效学评价方面，研究其对白血病细胞K562和HL-60的增殖，凋亡，细胞周期，侵袭和自噬的影响。通过分子对接模拟实验筛选其作用靶点，并在细胞和分子水平进行验证。进一步探讨化合物3ab抗白血病的分子机制并在体内评估化合物对K562移植瘤生长的抑制效果。
实验方法
1.筛选具有抗癌活性的吲哚化合物。
MTT法以顺铂(Cis，platin，DDP)作为阳性对照，筛选出具有抗癌活性的吲哚类化合物。检测化合物对HT-29、A549、K562细胞的抑制作用，然后筛选出抗癌活性最佳的化合物。
2.确定对化合物3ab敏感性强的癌症类型。
MTT法以DDP作为阳性对照，检测活性化合物3ab和3ai对多种肿瘤细胞(A549、H460、K562、HL-60、HT-29、B16、K562、MDA-MB-232、BGC-823、PC-3)的毒性。
3.检测化合物3ab对人正常细胞的毒性。
MTT法以DDP作为阳性对照，检测化合物3ab对人脐静脉内皮细胞HUVECs、人正常胃粘膜细胞GES-1的抑制作用。
4.检测化合物3ab对K562和HL-60细胞形态的影响。
采用倒置显微镜观察化合物3ab对K562和HL-60形态的影响。
5.检测K562和HL-60细胞对化合物3ab的摄取。
通过流式细胞仪检测K562和HL-60细胞对化合物3ab的摄取情况。
6.检测化合物3ab诱导K562/HL-60细胞凋亡的情况。
Hoechst33342法检测化合物3ab诱导K562和HL-60细胞凋亡的情况。AnnexinV-FITC/PI染色后，利用流式细胞仪量化化合物3ab诱导的K562细胞的凋亡情况。进一步采用JC-1荧光探针法检测化合物3ab作用K562和HL-60细胞后对线粒体膜电位变化情况。最后采用Westernblotting方法检测化合物3ab作用K562和HL-60细胞后对凋亡相关蛋白水平的影响。同时采用DCFH-DA荧光探针法检测化合物3ab作用K562和HL-60细胞后对ROS水平的影响。
7.检测化合物3ab对K562和HL-60细胞周期分布的影响。
PI染色后，经流式细胞仪检测K562和HL-60细胞经不同浓度的化合物3ab处理后，周期分布是否发生变化。同时，采用Westernblotting方法检测化合物3ab对G2/M期相关蛋白CDK1和CyclinB1表达水平的影响。
8.检测化合物3ab对K562和HL-60细胞侵袭能力的影响。
Transwell侵袭实验检测K562和HL-60细胞经不同浓度的化合物3ab处理后，侵袭能力是否发生变化。
9.检测化合物3ab对K562和HL-60细胞自噬水平的影响。
吖啶橙染色法检测K562和HL-60细胞经不同浓度的化合物3ab处理后，自噬水平是否发生变化。
10.采用计算机模拟技术筛选化合物3ab的作用靶点。
采用计算机模拟技术进行吲哚相关靶点蛋白与化合物3ab的对接模拟，对化合物3ab在K562和HL-60细胞中的可能作用靶点进行筛选。
11.检测化合物3ab对K562和HL-60细胞微管蛋白的影响。
免疫荧光实验检测K562和HL-60细胞经不同浓度的化合物3ab处理后，微管蛋白是否发生变化。然后，通过EBI竞争性结合实验检测化合物3ab是否是通过作用于微管蛋白秋水仙碱位点来发挥周期阻滞作用。
12.检测化合物3ab对K562和HL-60细胞中HDAC6蛋白及相关通路蛋白的影响。
Westernblotting方法检测K562和HL-60细胞经不同浓度的化合物3ab处理后，HDAC6蛋白及相关通路蛋白表达量是否发生变化。
13.检测化合物3ab对裸鼠K562移植瘤的生长抑制作用。
通过皮下注射人慢性髓原白血病K562细胞，小鼠移植瘤模型建立，每三天尾静脉给药一次并且连续18天，每天观察裸鼠状态，并且每三天记录一次裸鼠体重，瘤长，瘤宽。待实验结束，刨出移植瘤，称重并拍照保存，并将移植瘤一部分进行冷冻切片后免疫荧光染色，观察微管蛋白的变化，另一部分提蛋白后Westernblotting方法检测HDAC6水平的变化。
实验结果
1.MTT实验结果发现化合物3ab和3ai对K562细胞增殖的IC50值相对其他细胞株较小，分别为4.8μM和13.3μM，3ab对K562细胞的抑制作用高于3ai，且3ab对K562细胞增殖的IC50值低于DDP。所以选取化合物3ab、3ai进行下一步敏感肿瘤细胞的筛选。
2.化合物3ab、3ai对于乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、肝癌细胞(K562)、结肠癌细胞(HT-29)、胃癌细胞(BGC-823)、白血病细胞(K562和HL-60)、黑色素瘤细胞(B16)、前列腺癌细胞(PC-3)都具有较好的抑制作用，3ab的IC50值范围为4.63～35.17μM，3ai的IC50值范围为8.87～39.42μM。由于3ab的IC50低于3ai，并且3ai的稳定性较差，所以最终选择3ab作为研究对象，探讨其对白血病细胞的抗肿瘤作用及分子机制。
3.化合物3ab对人正常细胞的毒性较低，其在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中的IC50为14.73，在人正常胃粘膜细胞(GES-1)中的IC50为17.14μM，其数值都显著高于DDP。
4.K562和HL-60细胞经不同浓度的化合物3ab处理后，细胞形态发生变化，细胞碎片也明显增多，细胞变的大小不一，细胞数量明显减少。
5.化合物3ab可被K562和HL-60细胞摄取，并呈浓度依赖性积累。
6.化合物3ab可增加K562和HL-60细胞凋亡率，使线粒体膜电位下降。同时导致相关线粒体凋亡蛋白表达的变化，具体表现为Cleaved-PARP，Cleaved-Caspase3上调，Bcl-2下调。另外，化合物3ab还浓度依赖性的增加K562和HL-60细胞内的ROS水平。
7.化合物3ab作用于K562和HL-60细胞后，将细胞阻滞在G2/M期。G2/M期阻滞会导致相关周期蛋白的变化，上调CyclinB1和CDK1蛋白。
8.化合物3ab抑制K562和HL-60细胞的侵袭能力，呈现浓度依赖性。
9.化合物3ab不影响K562细胞的自噬能力，但能够浓度依赖性的提高HL-60细胞的自噬水平。
10.化合物3ab的作用位点可能是微管蛋白秋水仙碱位点和HDAC6的CD2部位。
11.化合物3ab诱导K562和HL-60细胞微管网络发生皱缩，聚集在核周围，且具有浓度依赖性。
12.化合物3ab作用于K562和HL-60细胞后，以浓度依赖性的方式显著下调了HDAC6的表达，并下调了EGFR，p-AKT和NF-κB的表达。
13.化合物3ab组裸鼠K562移植瘤的生长速度明显小于空白对照组，期间裸鼠体重没有发生显著降低的情况。化合物3ab组移植瘤中的细胞微管蛋白发生皱缩，红色荧光强度降低且具有浓度依赖性;同时，移植瘤中HDAC6的含量也随着化合物3ab浓度的升高而降低，提示化合物3ab可能是一种微管蛋白/HDAC6双靶点抑制剂。
实验结论
化合物3ab在体内外显著抑制K562和HL-60细胞的增殖，诱导白血病细胞凋亡和G2/M期阻滞，对侵袭和自噬均产生一定程度的影响。化合物3ab的抗白血病作用是通过与微管蛋白结合来抑制微管功能从而将细胞阻滞在G2/M期，最终导致细胞凋亡。同时，3ab通过与HDAC6结合并抑制其表达，继而下调EGFR/AKT/NF-κB通路激活细胞线粒体凋亡途径，同时增加白血病细胞内的ROS水平。因此，3ab可能是微管蛋白/HDAC6双靶点抑制剂，具有良好的抗肿瘤活性。
研究意义
本文筛选出来的吲哚化合物3ab，抗白血病效果好，体内外具有良好的抗增殖作用，并且具有促凋亡和抗侵袭等方面的作用。进一步研究了其作用靶点和细胞信号通路，提供了一种有潜力的具有微管蛋白/HDAC6双靶点抑制作用的吲哚化合物，可以此作为先导化合物进一步进行改造和优化，提高疗效降低毒性，以期为抗白血病的新型临床治疗药物提供新思路和新方法。
吲哚化合物存在于很多植物中，特别是十字花科蔬菜，例如:西蓝花、卷心菜、花椰菜，而食用十字花科蔬菜有助于抵抗癌症，导致许多癌症发病率的降低，例如前列腺癌，肺癌，乳腺癌和结直肠癌。癌症作为严重威胁人类健康的疾病之一，近年来随着生活节奏的加快，其发生率也逐渐上升。每年全球因癌症死亡的人数多达820万，据世界卫生组织报告，到2030年，患癌人数将达到2360万。已有研究表明，吲哚类化合物，在抗肿瘤方面表现出的良好生物活性，通常通过调节细胞周期，诱导凋亡，抑制血管生成和抑制细胞侵袭发挥抗癌作用。目前已经开发了多种吲哚类抗肿瘤药物应用于临床。在本论文中，我们通过筛选一系列吲哚化合物，发现抗癌效果较好的化合物3ab。在药效学评价方面，研究其对白血病细胞K562和HL-60的增殖，凋亡，细胞周期，侵袭和自噬的影响。通过分子对接模拟实验筛选其作用靶点，并在细胞和分子水平进行验证。进一步探讨化合物3ab抗白血病的分子机制并在体内评估化合物对K562移植瘤生长的抑制效果。
实验方法
1.筛选具有抗癌活性的吲哚化合物。
MTT法以顺铂(Cis，platin，DDP)作为阳性对照，筛选出具有抗癌活性的吲哚类化合物。检测化合物对HT-29、A549、K562细胞的抑制作用，然后筛选出抗癌活性最佳的化合物。
2.确定对化合物3ab敏感性强的癌症类型。
MTT法以DDP作为阳性对照，检测活性化合物3ab和3ai对多种肿瘤细胞(A549、H460、K562、HL-60、HT-29、B16、K562、MDA-MB-232、BGC-823、PC-3)的毒性。
3.检测化合物3ab对人正常细胞的毒性。
MTT法以DDP作为阳性对照，检测化合物3ab对人脐静脉内皮细胞HUVECs、人正常胃粘膜细胞GES-1的抑制作用。
4.检测化合物3ab对K562和HL-60细胞形态的影响。
采用倒置显微镜观察化合物3ab对K562和HL-60形态的影响。
5.检测K562和HL-60细胞对化合物3ab的摄取。
通过流式细胞仪检测K562和HL-60细胞对化合物3ab的摄取情况。
6.检测化合物3ab诱导K562/HL-60细胞凋亡的情况。
Hoechst33342法检测化合物3ab诱导K562和HL-60细胞凋亡的情况。AnnexinV-FITC/PI染色后，利用流式细胞仪量化化合物3ab诱导的K562细胞的凋亡情况。进一步采用JC-1荧光探针法检测化合物3ab作用K562和HL-60细胞后对线粒体膜电位变化情况。最后采用Westernblotting方法检测化合物3ab作用K562和HL-60细胞后对凋亡相关蛋白水平的影响。同时采用DCFH-DA荧光探针法检测化合物3ab作用K562和HL-60细胞后对ROS水平的影响。
7.检测化合物3ab对K562和HL-60细胞周期分布的影响。
PI染色后，经流式细胞仪检测K562和HL-60细胞经不同浓度的化合物3ab处理后，周期分布是否发生变化。同时，采用Westernblotting方法检测化合物3ab对G2/M期相关蛋白CDK1和CyclinB1表达水平的影响。
8.检测化合物3ab对K562和HL-60细胞侵袭能力的影响。
Transwell侵袭实验检测K562和HL-60细胞经不同浓度的化合物3ab处理后，侵袭能力是否发生变化。
9.检测化合物3ab对K562和HL-60细胞自噬水平的影响。
吖啶橙染色法检测K562和HL-60细胞经不同浓度的化合物3ab处理后，自噬水平是否发生变化。
10.采用计算机模拟技术筛选化合物3ab的作用靶点。
采用计算机模拟技术进行吲哚相关靶点蛋白与化合物3ab的对接模拟，对化合物3ab在K562和HL-60细胞中的可能作用靶点进行筛选。
11.检测化合物3ab对K562和HL-60细胞微管蛋白的影响。
免疫荧光实验检测K562和HL-60细胞经不同浓度的化合物3ab处理后，微管蛋白是否发生变化。然后，通过EBI竞争性结合实验检测化合物3ab是否是通过作用于微管蛋白秋水仙碱位点来发挥周期阻滞作用。
12.检测化合物3ab对K562和HL-60细胞中HDAC6蛋白及相关通路蛋白的影响。
Westernblotting方法检测K562和HL-60细胞经不同浓度的化合物3ab处理后，HDAC6蛋白及相关通路蛋白表达量是否发生变化。
13.检测化合物3ab对裸鼠K562移植瘤的生长抑制作用。
通过皮下注射人慢性髓原白血病K562细胞，小鼠移植瘤模型建立，每三天尾静脉给药一次并且连续18天，每天观察裸鼠状态，并且每三天记录一次裸鼠体重，瘤长，瘤宽。待实验结束，刨出移植瘤，称重并拍照保存，并将移植瘤一部分进行冷冻切片后免疫荧光染色，观察微管蛋白的变化，另一部分提蛋白后Westernblotting方法检测HDAC6水平的变化。
实验结果
1.MTT实验结果发现化合物3ab和3ai对K562细胞增殖的IC50值相对其他细胞株较小，分别为4.8μM和13.3μM，3ab对K562细胞的抑制作用高于3ai，且3ab对K562细胞增殖的IC50值低于DDP。所以选取化合物3ab、3ai进行下一步敏感肿瘤细胞的筛选。
2.化合物3ab、3ai对于乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、肝癌细胞(K562)、结肠癌细胞(HT-29)、胃癌细胞(BGC-823)、白血病细胞(K562和HL-60)、黑色素瘤细胞(B16)、前列腺癌细胞(PC-3)都具有较好的抑制作用，3ab的IC50值范围为4.63～35.17μM，3ai的IC50值范围为8.87～39.42μM。由于3ab的IC50低于3ai，并且3ai的稳定性较差，所以最终选择3ab作为研究对象，探讨其对白血病细胞的抗肿瘤作用及分子机制。
3.化合物3ab对人正常细胞的毒性较低，其在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中的IC50为14.73，在人正常胃粘膜细胞(GES-1)中的IC50为17.14μM，其数值都显著高于DDP。
4.K562和HL-60细胞经不同浓度的化合物3ab处理后，细胞形态发生变化，细胞碎片也明显增多，细胞变的大小不一，细胞数量明显减少。
5.化合物3ab可被K562和HL-60细胞摄取，并呈浓度依赖性积累。
6.化合物3ab可增加K562和HL-60细胞凋亡率，使线粒体膜电位下降。同时导致相关线粒体凋亡蛋白表达的变化，具体表现为Cleaved-PARP，Cleaved-Caspase3上调，Bcl-2下调。另外，化合物3ab还浓度依赖性的增加K562和HL-60细胞内的ROS水平。
7.化合物3ab作用于K562和HL-60细胞后，将细胞阻滞在G2/M期。G2/M期阻滞会导致相关周期蛋白的变化，上调CyclinB1和CDK1蛋白。
8.化合物3ab抑制K562和HL-60细胞的侵袭能力，呈现浓度依赖性。
9.化合物3ab不影响K562细胞的自噬能力，但能够浓度依赖性的提高HL-60细胞的自噬水平。
10.化合物3ab的作用位点可能是微管蛋白秋水仙碱位点和HDAC6的CD2部位。
11.化合物3ab诱导K562和HL-60细胞微管网络发生皱缩，聚集在核周围，且具有浓度依赖性。
12.化合物3ab作用于K562和HL-60细胞后，以浓度依赖性的方式显著下调了HDAC6的表达，并下调了EGFR，p-AKT和NF-κB的表达。
13.化合物3ab组裸鼠K562移植瘤的生长速度明显小于空白对照组，期间裸鼠体重没有发生显著降低的情况。化合物3ab组移植瘤中的细胞微管蛋白发生皱缩，红色荧光强度降低且具有浓度依赖性;同时，移植瘤中HDAC6的含量也随着化合物3ab浓度的升高而降低，提示化合物3ab可能是一种微管蛋白/HDAC6双靶点抑制剂。
实验结论
化合物3ab在体内外显著抑制K562和HL-60细胞的增殖，诱导白血病细胞凋亡和G2/M期阻滞，对侵袭和自噬均产生一定程度的影响。化合物3ab的抗白血病作用是通过与微管蛋白结合来抑制微管功能从而将细胞阻滞在G2/M期，最终导致细胞凋亡。同时，3ab通过与HDAC6结合并抑制其表达，继而下调EGFR/AKT/NF-κB通路激活细胞线粒体凋亡途径，同时增加白血病细胞内的ROS水平。因此，3ab可能是微管蛋白/HDAC6双靶点抑制剂，具有良好的抗肿瘤活性。
研究意义
本文筛选出来的吲哚化合物3ab，抗白血病效果好，体内外具有良好的抗增殖作用，并且具有促凋亡和抗侵袭等方面的作用。进一步研究了其作用靶点和细胞信号通路，提供了一种有潜力的具有微管蛋白/HDAC6双靶点抑制作用的吲哚化合物，可以此作为先导化合物进一步进行改造和优化，提高疗效降低毒性，以期为抗白血病的新型临床治疗药物提供新思路和新方法。