目的：通过基因芯片技术检测bFGF处理前后的大鼠视网膜Müller细胞基因表达，对比分析筛选显著差异表达的基因，并利用生物信息学方法分析差异表达基因的意义，为后续实验提供线索。在此基础上，利用实时定量PCR、免疫荧光标记等方法从基因和蛋白水平进一步探讨前列腺素E2对Müller神经胶质细胞干细胞潜能的调控作用，以期为视网膜变性疾病的治疗提供一种新的思路。方法：利用基因芯片检测和生物信息学分析诱导前后Muller细胞基因表达差异，进行GO分类，预测相关信号通路。用Elisa法检测PGE2的含量变化。以及用实时荧光PCR、免疫荧光染色等方法检测目的基因和蛋白的表达。结果：基因芯片结果分析显示，差异表达的基因涉及神经系统发育、G蛋白偶联受体、前列腺素生物合成、刺激应答、免疫反应、细胞增殖、细胞凋亡、生长因子等基因种类。PGE2对bFGF诱导的Muller细胞增殖和去分化有促进作用。结论：大鼠视网膜Müller神经胶质细胞的前体细胞/干细胞潜能的激活受多种因素的调节。PGE2信号通路可能参与了bFGF诱导的大鼠视网膜Müller细胞前体细胞/干细胞特性激活的调节过程。　　 研究目的：　　 有证据表明，神经胶质细胞可能是中枢神经系统神经元的再生来源。Müller细胞是视网膜组织中的主要神经胶质，对视网膜神经元结构与功能的维持起到了重要作用，与中枢神经系统中的星形胶质细胞功能相似。在脊椎动物包括斑马鱼、小鼠、大鼠和鸡等的视网膜中，损伤刺激可诱导Müller细胞去分化为前体样细胞，并且能向神经元转化。这提示除冷血脊椎动物以外，哺乳动物的Müller细胞可能也具有神经再生能力。但是只有足够的损伤，才能引起少量的Müller细胞增殖、分化。因此，深入研究Müller神经胶质细胞向干细胞转化的调控机制，将成为利用Müller神经胶质细胞前体细胞/干细胞特性治疗视网膜变性疾病的重要突破口。bFGF和EGF可诱导体外培养的大鼠Müller细胞产生神经球、表达视网膜前体细胞标志物。但是它们诱导Müller细胞产生前体细胞/干细胞特性的机制还并不清楚。本课题首先通过基因芯片技术检测EGF，bFGF处理前后的大鼠视网膜Müller细胞基因表达，对比分析筛选差异表达的基因，并利用生物信息学方法分析差异表达基因的意义，为后续实验提供线索。在此基础上，利用实时定量PCR、免疫荧光标记等方法从基因和蛋白水平进一步探讨前列腺素E2对Müller神经胶质细胞干细胞潜能的调控作用，以期为视网膜变性疾病的治疗提供一种新的思路。　　 研究方法：　　 1.选用出生后10～21天的SD大鼠。无菌条件下取出眼球，钝性分离视网膜，注意避免视网膜色素上皮和睫状体上皮细胞的污染。用0.1％胰蛋白酶和70U/ml胶原酶I消化视网膜组织，37℃，30min。消化得到的视网膜细胞培养在含有10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养液中。细胞贴壁后，隔日换液。通过传代培养获得进一步纯化的Müller神经胶质细胞。通过流式细胞术对Müller细胞进行纯度分析。0.25％胰蛋白酶-EDTA消化经纯化培养的Müller神经胶质细胞，离心、去上清，含有生长因子的无血清培养基(DMEM/F12+10ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、1×N2添加物、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素)重悬细胞，接种在25cm2的培养瓶或装有盖玻片的24孔板中，诱导Müller神经胶质细胞表达神经前体细胞/干细胞标志物，产生神经球。免疫荧光双标法观测细胞特异性标记物的表达。　　 2.通过提取纯化培养的Müller神经胶质细胞(对照组)和经诱导后产生神经球的细胞(处理组)样本的总RNA。利用Illumina大鼠基因表达谱芯片检测两组样本的基因表达情况。用BeadStudio分析软件将扫描获取的荧光信号强度进行归一化处理，使用I1lumina自行开发的算法求Diffscore值，比较一种基因探针在两种组织中的表达差异程度。通过生物信息学方法，分析差异表达基因的意义。实时定量PCR验证基因表达差异。　　 3.分别用bFGF、PGE2及PGE2信号通路的抑制剂处理体外培养的Müller细胞。在处理后的48h收集各组细胞培养液上清，用Elisa法检测PGE2的含量变化。用实时定量PCR方法检测PGE2信号上游基因COX2、前体细胞/干细胞相关基因(nes、Pax6)、细胞周期基因(ccnd1)在不同处理组之间的表达差异。通过免疫荧光标记法在蛋白水平检测Nestin、Pax6等标志物在各组的表达。　　 研究结果：　　 1.流式细胞术检测原代培养的Müller神经胶质细胞的纯度为95％。免疫荧光双标结果显示培养的细胞共同表达Müller标记物Vimentin和Glutamine synthetase，同时在所检测的细胞中未见其它视网膜神经元特异性标记物的表达。　　 2.免疫荧光标记结果显示诱导后的Müller细胞表达神经干细胞及视网膜前体细胞标记物Nestin和Pax6。实时定量PCR结果显示诱导后Nestin、Pax6基因表达升高。　　 3.基因芯片结果分析显示，差异表达的基因涉及神经系统发育、G蛋白偶联受体、前列腺素生物合成、刺激应答、免疫反应、细胞增殖、细胞凋亡、生长因子等基因种类。　　 4.通过PGE2 Elisa试剂盒检测细胞培养液中PGE2的含量，结果显示bFGF处理后，培养液中PGE2的含量增加。实时定量PCR检测结果显示，bFGF+PGE2处理组的细胞ccnd1、nestin和pax6等的基因表达量相对较高。免疫细胞化学标记结果也提示PGE2促进Müller细胞前体细胞标记物和细胞周期相关蛋白的表达。　　 结论：　　 1.大鼠视网膜Müller神经胶质细胞的前体细胞/干细胞潜能的激活受多种因素的调节。深入研究这些因素在Müller神经胶质细胞增殖、分化过程中的作用，有利于进一步了解Müller细胞向前体细胞/干细胞转化的分子机制，并为将来以具有干细胞特性的Müller细胞为基础的、针对视网膜变性疾病的治疗策略提供理论依据。　　 2.PGE2信号通路可能参与了bFGF诱导的大鼠视网膜Mül ler细胞前体细胞/干细胞特性激活的调节过程。