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猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的猪的高度接触性、传染性疾病,给养猪业造成巨大威胁和经济损失,被世界动物卫生组织(OIE)列为必须报告的法定传染病之一。CSF在我国时有暴发,被列为一类动物传染病,已纳入国家强制免疫计划。猪瘟兔化弱毒疫苗株(Hog Cholera Lapinized Virus,HCLV)(国际上称为C株),能引起兔体发热,细胞培养生长能力差,病毒滴度较低;猪瘟Theveral株(T株)是法国的一株低温诱变弱毒株,不引起兔体发热,细胞培养生长良好,病毒滴度较高。猪瘟病毒基因组的5′非编码区(5′-untranslated region,5′-UTR)是病毒蛋白翻译的主要调控区,没有帽子结构,具有内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Enty Site,IRES)。猪瘟病毒的翻译起始由IRES介导的不依赖帽子结构的机制完成。IRES结构和功能的改变直接影响病毒的翻译效率。我们推测CSFV 5′非编码区(5′-UTR)一级、二级结构的差异是造成CSFV C株和CSFV T株细胞适应性和病毒滴度不同的一个重要因素。本研究利用生物学软件分析比较了HCLV株、Thiverval株、石门株5′-UTR一级结构和二级结构。一级结构研究表明,CSFV C株、Thiverval株、Shimen株共有14个位点处碱基差异,其余部位完全相同,在14个位点差异中,有7个位点猪瘟Thiverval株和石门株碱基相同而与CSFV C株不同。二级结构研究表明,CSFV T株和石门株在5′-UTR结构域II和结构域III处茎环结构和数量基本无差异而与CSFV C株有明显差异,而猪瘟Thiverval株和石门株碱基相同而与CSFV C株不同的7个差异位点中,123位位于CSFV 5′-UTR结构域II上,138位和228位位于结构域III。前人研究表明在二级结构上,CSFV 5′-UTR的结构域II和结构域III对IRES功能影响较大。二级结构预测还表明CSFV C株5′-UTR自由能高于CSFV T株和石门株,自由能上升加剧其二级结构的不稳定性,可能影响病毒RNA的合成。为研究5′非编码区与CSFV C株细胞适应性和病毒滴度的关系,本研究运用反向遗传操作技术,在本实验室已构建的C株和T株感染性cDNA克隆的基础上,构建两株猪瘟嵌合病毒质粒pT5′-UTR-C和pC5′-UTR–T。通过电转染细胞成功拯救得到两株嵌合病毒vT5′-UTR-C和vC5′UTR-T,通过它们在细胞上的生长特性探讨5′-UTR与CSFV C株细胞适应性和病毒滴度之间的关系。研究表明,猪瘟嵌合病毒vT5′-UTR-C的病毒滴度比CSFV C株有所提高,即用CSFV T株5′-UTR替换C株相应片段后能改善C株在细胞上的适应性,提高其病毒滴度,证明5′-UTR影响CSFV C株的增殖效率。为研究5′-UTR与兔体反应热的关系,本研究将嵌合病毒接种兔子,观察兔子体温反应。结果显示,嵌合病毒vT5′-UTR-C可以导致兔子发热,攻毒嵌合病毒vC5′-UTR-T组兔子体温正常,说明5′-UTR与兔热反应无关。为研究猪瘟嵌合病毒对猪的影响,将嵌合病毒接种猪,猪只均没有异常表现。综合以上结果表明5′-UTR与CSFV C株在细胞上的增殖速率有关,用T株5′-UTR替换C株相应片段能改善C株细胞适应性,提高病毒滴度,同时也表明5′-UTR与兔热反应无关,但5′-UTR不是CSFV C株细胞适应性的唯一决定因素。