论文部分内容阅读
恶性淋巴瘤是淋巴结和结外部位淋巴组织的免疫细胞肿瘤,来源于淋巴细胞或组织细胞的恶变。淋巴瘤的发病率和死亡率正在迅速上升,欧洲、美洲和澳大利亚等西方国家的发病率可高达11/10万~18/10力。在美国每年至少发现新病例3万以上。从我国1990-1992年22个省(区)市抽样人门调查的情况来看,平均年粗死亡率为1.46/10万,中位死亡年龄为56.88岁:我国恶性淋巴瘤患者发病率和死亡率在男性居全部恶性肿瘤排序的第9位。恶性淋巴瘤的流行病学特点,除了地理、民族的差别外,从工业发达国家和城市多发的情况看,生活和环境等因素也与本病的流行病学密切相关;恶性淋巴瘤在我国沿海地区发病率较高;近些年,随着艾滋病发病率增高,恶性淋巴瘤的发病率也随之升高。
运用中草药治疗恶性肿瘤,近年来越来越被广大学者和患者接受,并已成为常用的治疗方法,是恶性肿瘤综合治疗中的有效手段之一。夏枯草作为一种传统的中草药,具有清火明目、软坚散结之功效。夏枯草主要含有三萜及其苷类、甾醇及其苷类、苯丙素类、香豆素、黄酮类、有机酸、挥发油及糖类等,具有及其重要的药用价值和广泛的药理作用,引起了人们越来越多的关注。夏枯草辅助化疗药物治疗淋巴瘤,在肿瘤综合治疗中显示了良好的临床疗效。近年来,国内外学者对夏枯草进行了深入广泛的研究,尤其是对夏枯草的化学成分和药理作用方面,本课题组亦做了大量的研究,前期研究表明夏枯草辅助化疗药物治疗淋巴瘤具有较好的疗效,夏枯草具有抑制淋巴瘤细胞生长的作用。
Akt是体内重要的生存信号通路磷酯酰肌醇3激酶(Phosphoinositide3 Kinase, PI3K)/Akt中的关键分子。p-Akt水平的增加可导致PI3K/Akt细胞生存通路的活化,促进细胞的生长、增殖、侵袭、转移等,在肿瘤发生、发展中起重要作用。MAPK是细胞内的重要信号转导通路,能够对环境中发生的改变作出激酶活性改变的反应,并且把这种反应在细胞内以信号形式进行传递。JNK信号转导通路是实现细胞凋亡的重要途径之一。在夏枯草抑制淋巴瘤细胞生长的机制中,Akt和MAPK信号转导通路是否具有作用以及起着什么作用,因此本研究旨在验证Akt和MAPK信号转导通路在夏枯草对淋巴瘤细胞抑制作用的发生及其机制,明晰夏枯草抑制淋巴瘤细胞生长的真正作用机制,以便指导临床更科学地应用夏枯草。
研究方法:
1.夏枯草对淋巴瘤Raji细胞Akt通路的影响
采用3种方式处理人淋巴瘤Raji细胞,即夏枯草组(50g/L夏枯草)、wortmannin组(50g/L夏枯草及1μmol/L wortmannin)和对照组(同体积生理盐水);噻唑蓝比色法检测细胞增殖率;流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期的变化;提取细胞总蛋白,分别检测各组p-Akt以及Caspase-3等的表达变化,同时做体内实验的验证。
2.MAPK在夏枯草抑制淋巴瘤Raji细胞生长中的作用
采用5种方式处理人淋巴瘤Raji细胞,即夏枯草组(50g/L夏枯草)、PB98059组(50g/L夏枯草及10μmol/L PB98059)、SP600125组(50g/L夏枯草及20μmol/LSP600125)、SB205380组(50g/L夏枯草及10μmol/LSB205380)和对照组(同体积生理盐水);噻唑蓝比色法检测细胞增殖率;流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期的变化;提取细胞总蛋白,分别检测各组p-JNK、p-Erk、p-P38以及Caspase-3等的表达变化,同时做体内实验的验证。
3.统计学分析
计量资料用均数±标准差表示,计数资料用率表示,用EXCEL2003建立数据库,采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析,统计学方法采用t检验、单因素方差分析,多重比较采用LSD法,构成比的比较采用卡方检验,以α取0.05为检验水准。
结果:
1.夏枯草对淋巴瘤细胞生长的影响
1.1淋巴瘤细胞增殖率的变化
夏枯草可以明显抑制淋巴瘤细胞的生长(P<0.05),wortmannin和PB98059组细胞增殖率减少,SP600125和SB205380组细胞增殖率增加(P<0.05)。
1.2淋巴瘤细胞凋亡率的变化
夏枯草组细胞凋亡率增加(P<0.05),wortmannin和PB98059组细胞凋亡率进一步增加,SP600125和SB205380组细胞凋亡率减少(P<0.05)。
1.3淋巴瘤细胞周期的变化
夏枯草组G0/G1期和G2/M期细胞增多,S期细胞减少(P<0.05),wortmannin和PB98059组S期细胞更少,SP600125和SB205380组G2/M期细胞减少(P<0.05)。
2.细胞内重要信号传导通路在夏枯草抑制淋巴瘤细胞生长中的作用
2.1 p-Akt水平的变化
夏枯草组的Akt信号转导通路被抑制,p-Akt的水平低于对照组(P<0.05),wortmannin组的p-Akt水平完全被抑制(P<0.05),说明在夏枯草抑制淋巴瘤细胞生长的过程中,Akt通路被抑制。
2.2 p-Erk水平的变化
夏枯草组的Erk信号转导通路被抑制,产生的p-Erk低于对照组(P<0.05),PB98059组的p-Erk水平被进一步抑制(P<0.05),说明在夏枯草抑制淋巴瘤细胞生长的过程中,Erk信号转导通路被抑制。
2.3 p-JNK和c-Jun水平的变化
夏枯草组的JNK信号转导通路被激活,产生的p-JNK和p-c-Jun高于对照组(P<0.05),SP600125组的p-JNK和p-c-Jun水平被抑制(P<0.05),说明在夏枯草抑制淋巴瘤细胞生长的过程中,JNK信号转导通路被激活。
2.4 p-P38水平的变化
夏枯草组的P38信号转导通路被激活,产生的p-P38高于对照组(P<0.05),SB205380组的p-P38水平被抑制(P<0.05),说明在夏枯草抑制淋巴瘤细胞生长的过程中,P38信号转导通路被激活。
2.5 Caspase-3表达水平的变化
夏枯草组的Caspase-3表达水平高于对照组(P<0.05),wortmannin和PB98059组的Caspase-3表达水平高于夏枯草组(P<0.05),SP600125组的Caspase-3表达水平低于夏枯草组(P<0.05),SP600125和SB205380组的Caspase-3表达水平低于夏枯草组(P<0.05),说明在夏枯草抑制淋巴瘤细胞生长的过程中,细胞凋亡可以通过这4条通路传给caspase途径引发,且Akt和Erk通路对其有抑制作用,JNK和P38信号转导通路对caspase有活化作用。
结论及创新点:
1.在夏枯草抑制淋巴瘤细胞生长的机制研究中,证明夏枯草可以明显抑制淋巴瘤细胞的生长,诱导淋巴瘤细胞凋亡的发生和细胞周期的变化;
2.通过使用通路抑制剂说明,夏枯草可以抑制Akt通路的活化,抑制Erk信号转导通路的活化,激活JNK和P38信号转导通路,通过caspase途径诱导细胞凋亡的发生,以上结论在体内试验中得到证实,经中国知网和PUBMED检索,未见类似报道。