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目的:肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)引起的血管内皮损伤在很多心血管疾病的发病机制中扮演着重要角色,miR-29a高表达于人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cells,HUVECs)且参与调节细胞的增殖与凋亡。到目前为止,miR-29a在TNF-α诱导的HUVEC中的作用及其信号路径尚无报道,本研究的目的在于探讨miR-29a在TNF-α诱导的HUVEC中的表达及其在增殖与凋亡中的调节作用。 方法: (1)采用MTT法检测不同浓度TNF-α(0 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml)分别处理不同时间(24 h、36 h、48 h)对HUVECs增殖的影响;然后用不同浓度TNF-α(0 ng/ml、1 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml)处理HUVECs不同时间(0 h、12 h、24 h、36 h、48 h),通过Heochst33342染色、Annexin V-FITC/ PI双染法、Western blot法检测HUVECs的凋亡程度,筛选出TNF-α诱导HUVECs增殖与凋亡的最佳浓度和时间; (2)采用实时荧光定量PCR法检测miR-29a/b/c在TNF-α诱导的HUVECs中的表达,筛选出表达变化的miRNA; (3)采用MTT法检测不同浓度miR-29a mimics(0 nmol/L、25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、150 nmol/L)分别转染不同时间(24 h、36 h、48 h)对HUVECs增殖活力的影响,筛选最佳转染浓度和时间;再用实时荧光定量PCR法检测过表达和抑制表达miR-29a对HUVECs中miR-29a表达的影响;MTT法检测 miR-29a对 TNF-α诱导的HUVECs增殖的影响;Heochst33342和Annexin V-FITC/ PI双染法检测其凋亡;Western blot分析检测其对凋亡相关蛋白 Bax、Bcl-2、caspase-3表达的影响; (4)使用miRanda和Tangetscan软件分析,结合目前文献的报道,预测miR-29a的凋亡相关靶基因,采用Western blot法检测其靶基因的表达变化;再采用MTT法和Annexin V-FITC/PI双染法分别检测其靶基因在 TNF-α诱导的HUVECs增殖与凋亡中的调控作用。 结果: (1)TNF-α呈剂量和时间依赖性抑制HUVECs增殖及促进其凋亡,且筛选出最佳的诱导浓度为10 ng/ml、时间为24 h。 (2)TNF-α(10 ng/ml)处理HUVECs24 h后,相比于空白对照组,miR-29a的表达明显上调(P<0.001),而miR-29b/c的表达无变化。 (3)MTT结果显示:过表达miR-29a能显著抑制TNF-α诱导的HUVECs增殖(P<0.001),而抑制表达 miR-29a则呈现相反趋势的结果;Heochst33342染色、Annexin V-FITC/ PI双染法和Western blot法结果显示:过表达 miR-29a能显著促进 TNF-α诱导的HUVECs凋亡(P<0.001),而抑制表达miR-29a能显著抑制TNF-α诱导的HUVECs凋亡(P<0.001)。 (4)生物信息学分析及目前文献的报道发现PI3K3R1(p85α)、AKT3、Bcl-2是miR-29a的潜在靶基因;Western blot结果发现TNF-α(10ng/ml)诱导的HUVECs的p85α、Bcl-2蛋白表达下调;miR-29a通过下调 PI3K3R1(p85α)、Bcl-2的表达负调节PI3K/AKT/Bcl-2通路;MTT和Annexin V-FITC/ PI双染结果证明:阻断PI3K/AKT/Bcl-2通路能减弱anti-miR-29a的促进增殖及抑制细胞凋亡的效应。 结论:本研究证实miR-29a通过下调PI3K/AKT/Bcl-2通路抑制TNF-α诱导的HUVECs增殖及促进其凋亡,TNF-α诱导表达的miR-29a在动脉粥样硬化的发病机制中起着重要的调控作用,因此,靶向miR-29a能为动脉粥样硬化治疗提供新的策略。