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香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,Foc)引起的维管束系统性病害,对香蕉生产造成毁灭性的破坏,引起了巨大的经济损失。香蕉枯萎病菌1号小种(Foc1)属于世界性分布,主要侵染粉蕉(Musa AAB),但香蕉(Cavendish AAA)较抗病;4号小种(Foc4)几乎能感染所有的香蕉品种,为害最严重。由于缺乏有效的防治方法和抗病品种,通过筛选致病相关基因,完善香蕉枯萎病菌致病机理就显得尤为重要。在本研究室已获得的三种碳源诱导条件下香蕉枯萎病菌2小种转录组差异分析基础上,将转录组结果与PHI(The Pathogen-Host Interaction Database)数据库BLAST比对,预测致病相关基因,筛选出5个致病相关基因:转录因子comp11743(Mads1,PHI:1070),效应子comp13556(Flo1,PHI:468),HC-毒素合成酶comp14892(PHI:157),G蛋白comp17731(PHI:385),几丁质合成酶comp20887(PHI:389)。实时荧光定量PCR得到了5个基因在Foc处理香蕉根后的表达量变化,comp11743(Mads1)和comp13556(Flo1)表达量上调十分明显,comp11743(Mads1)在48h和96h的表达量至少较0h上调400倍,最大可以达到900多倍;comp13556(Flo1)在48h和96h的表达量虽然较0h上调的倍数不及comp11743(Mads1),但是平均都在90倍以上,最大可以达到将近400倍;尽管comp14892在Foc处理香蕉根部后表达量也有上调,但是上调倍数不大,远远不及comp11743(Mads1)和comp13556(Flo1),而comp17731和comp20887在Foc处理香蕉根后表达量都呈下调趋势。由于病原菌在侵染寄主时,有些基因会大量表达,因此本研究优先选择comp11743(Mads1)和comp13556(Flo1)这2个基因进行后续研究。基因克隆测序显示:Foc1-comp11743(Mads1)和Foc4-comp11743(Mads1)DNA大小都为633bp,DNA编码区都为633bp,都编码210个氨基酸的蛋白,都无内含子,2个小种基因编码区域同源性为100%,编码的氨基酸同源性为100%。Foc1-comp13556(Flo1)和Foc4-comp13556(Flo1)DNA大小都为1010bp,DNA编码区都为960bp,都编码319个氨基酸的蛋白,Foc1-comp13556(Flo1)和Foc4-comp13556(Flo1)都由1个内含子和2个外显子组成,外显子区域同源性为99.1%,Foc1-comp13556和Foc4-comp3556在核苷酸水平上存在着10个位点差异,编码的氨基酸同源性为99.4%,存在2个位点的差异。将comp11743(Mads1)、comp13556(Flo1)氨基酸序列BLASTP比对之后发现,comp11743(Mads1)具有一个MADS_SRF_like功能域,属于MADS家族中的SRF-like(I)型蛋白,因此命名为Mads1;comp13556(Flo1)具有一个PA14功能域,属于PA14家族,与FLO(Flocculation protein)有50%同源,命名为Flo1。通过TAIL-PCR获得了Foc1-Mads1、Foc4-Mads1以及Foc1-Flo1、Foc4-Flo1目的基因的侧翼序列。采用同源重组的方法,根据所测得的目的基因两端侧翼序列构建敲除载体,利用ATMT方法进行转化,成功获得了将Foc1和Foc4-Mads1、Flo1基因缺失的突变体Foc1-△Mads1、Foc4-△Mads1以及Foc1-△Flo1、Foc4-△Flo1。Foc1-△Mads1和Foc4-△Mads1在PDA平板上的培养形态基本与野生型Foc1、Foc4一致,其菌丝生长速度也与野生型Foc相一致,产孢量与野生型Foc没有差异。Foc1-△Flo1和Foc4-△Flo1在PDA平板上的培养形态基本与野生型Foc1、Foc4一致,其菌丝生长速度也与野生型的Foc相一致,产孢量与野生型Foc没有差异。采用浸根接种的方法,将Foc1-△Mads1、Foc4-△Mads1以及Foc1-△Flo1、Foc4-△Flo1敲除突变体和野生型Foc接种四叶期的粉蕉和巴西蕉苗,45 d后观察结果。结果表明,Foc1-△Mads1、Foc4-△Mads1接种的粉蕉和巴西蕉病情指数分别是95±1.44a、92.5±1.44a与野生型Foc相比差异不显著,说明△Mads1基因的敲除对致病力未造成太大影响;而Foc1-△Flo1、Foc4-△Flo1接种的粉蕉和巴西蕉病情指数分别是51.66±0.83、53.33±2.2,较野生型Foc1、Foc4的病情指数低50%左右,这初步说明△Flo1基因的缺失虽然不影响Foc的正常生长,却在一定程度上减弱了致病力。综上所述,Mads1基因和Flo1在Foc侵染时大量表达,Flo1初步证明可能与Foc致病力相关;Mads1应该在侵染过程中伴有一定作用,但是敲除后对致病力没有明显影响,可能是MADS-Box家族具有功能冗余,即存在着多个功能相同的基因,当敲除其中一个基因时,其缺失的功能会被同家族其它基因互补。因此,后续试验可以克隆更多该家族其它基因进行研究。