B淋巴细胞刺激因子(BLyS)是1999年发现的TNF超家族新成员，它在B淋巴细胞的存活、分化、成熟等生理过程中起着重要的调节作用，而过量表达的BLyS则与自身免疫性疾病的发生、发展密切相关，因此BLyS受到基础研究者和临床研究者的青睐。而BLyS在正常人和病人血清中的含量甚微，所以建立一种高效灵敏的检测手段成为研究BLyS中的一项重要内容。 在众多的标记免疫分析技术中，时间分辨荧光免疫分析技术(TRFIA)因具有本底极低、灵敏度高、重复性好、特异性强、线性范围宽和应用广泛等特点而成为当前最有前景的超灵敏免疫分析技术之一。用TRFIA来分析血清中的BlyS水平将为临床进行定量研究创造条件。 该研究首先以原核方式克隆、表达了重组人BlyS，然后以重组人作为标准品，建立了检测人血清中BLyS的时间分辨荧光免疫分析方法，并对其作了方法学评价。 第一部分 人外周血单个核细胞中BLyS127-285的克隆和表达 根据BlyS基因序列合成特异性引物，并利用RT-PCR的技术从人外周血单个核细胞中克隆出BlyS基因的胞外区BLyS127-285cDNA，通过琼脂糖电泳分析PCR产物，胶回收目的基因片断，连接到pGEM-T克隆载体中，转化大肠杆菌，酶切分析阳性克隆，将阳性克隆质粒命名为BlyS-pGEM-T。经DNA测序仪鉴定序列，结果显示重组质粒中的目的片断与GenBank中的cDNA序列完全一致。将测序正确的BlyS-pGEM-T和表达载体pQE-30进行双酶切，将目的基因片断亚克隆至pQE-30中，然后转化大肠杆菌DH5α，经酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为BLyS-pQE-30。然后用1mmol/l的IPTG进行诱导时间的优化，同时将表达的重组人BlyS127-285进行SDS-PAGE和western-blot鉴定，结果携带BLyS-pQE-30的大肠杆菌DH5α菌株，经IPIG诱导表达了重组目的蛋白，主要位于菌体包涵体内，其相对分子质量约为19000，表达量可达菌体总蛋白的49.8％。将将含重组质粒BLyS-pQE-30的大肠杆菌DH5α扩大培养，1mmol/LIPTG37℃诱导表达4h。用包涵体溶解缓冲液将收集的细胞进行超声破碎，然后经Ni-NTA层析柱进行纯化回收目的重组蛋白。最后将纯化的目的蛋白进行透析复性。 第二部分 BLyS时间分辩荧光免疫分析方法的建立 首先制备Eu3+-pAb：将山羊抗人BLyS多克隆抗体(pAb)经PD-10柱转换缓冲条件，与标记试剂盒中的Eu3+-DTTA在碳酸盐缓冲液(pH8.5)中30℃进行标记20h，反应液SepharoseCL-6B柱纯化，结果pAb每个分子(IgG)平均标记上4.26个Eu3+。经检定，标记物-20℃保存三个月后其活性基本不变，非常稳定。与进口的增强液对比，自制的增强液具有良好的增强性能。然后对反应的各个条件如：包被缓冲液种类、抗体包被浓度、包被温度和时间、封闭温度和时间、标记物Eu3+-pAb的浓度、两次反应的温度和时间等绘制标准曲线，对BLyS时间分辩荧光免疫分析方法进行优化，在综合考虑分析灵敏度和信噪比以及实用性角度的原则上选择优化方案。优化后的BLyS时间分辩荧光免疫分析方法分析步骤为：用柠檬酸盐缓冲液将mAb稀释成20ug/ml，每孔加200ul，用封孔膜封闭后，4℃24h。洗涤液洗3次，每次浸泡30秒，扣干(下同)。每孔加350ul封闭缓冲液，4℃24h。洗涤液洗3次。每孔加200ul样品或标准品，25℃低速振荡孵育2h。洗涤液洗4次。每孔加用反应缓冲液稀释1000倍的pAb-Eu3+200ul，25℃低速振荡孵育2h。洗涤液洗6次。每孔加增强液200ul，25℃低速振荡孵育10min。上机检测各孔的荧光强度(cps)，通过查找标准曲线得出样品中BlyS的含量。最后进行的方法学评价显示，该文建立的BLyS时间分辩荧光免疫分析方法具有良好的灵敏度(0.2ng/ml)，宽阔的线性范围(100ng/ml以上)，较高的精密度(CV小于10％)和准确度，良好的健全性和相关性(同ELSIA)。