研究背景慢性肾病是多年来全球公认的主要死亡原因之一,而肾脏纤维化几乎是所有慢性肾脏疾病的共同病理特征,也是肾功能衰竭的主要决定因素。但是目前仍然没有针对性的治疗方法能够减缓慢性肾病的进展以及预防其相关并发症,因此,慢性肾病的防治已经成为一个不可忽视的全球公共卫生问题。G蛋白偶联受体（GPCRs）是一个膜受体家族,它响应细胞外信号,参与各种器官的多种生理过程。尽管GPCRs约占药物靶点的30%,但大多数成员在临床中的作用仍然是未知的。因此,进一步确定参与肾纤维化发病机制的关键GPCRs可能会导致更有效的治疗CKD的方法。溶血磷脂酸（LPA）是一种普遍存在的小分子磷脂,能够参与多种生理和病理过程,包括细胞的存活、增殖、迁移和收缩。它对不同器官的纤维化进展至关重要。同时,作为GPCRs的配体,LPA的生物学功能是通过一些GPCRs介导的,这些GPCRs也被称为LPA受体。因此,靶向这些LPA受体可能成为治疗各种器官纤维化的新策略。在GPCRs中,GPR87被确定为一种新的LPA受体,并调节许多肿瘤的进展,包括膀胱癌、肺癌、胰腺癌、皮肤癌和宫颈癌。因此,GPR87作为一个有前景的肿瘤治疗靶点正受到人们的关注。另外有蛋白质组学分析显示,马兜铃酸肾病（AAN）小鼠肾脏中GPR87的表达显著上调。同时,我们发表的一个RNA-SEQ数据表明,阿霉素处理后的足细胞中GPR87表达显著升高。这提示GPR87基因可能在慢性肾脏病的发生发展中起重要作用,但其具体作用机制仍待进一步探究。研究目的1.明确GPR87在肾脏纤维化模型以及CKD患者肾脏中的表达变化及定位情况。2.探究GPR87在肾脏间质纤维化进程中作用功能。3.探讨GPR87在肾脏间质纤维化发展过程中的作用机制,为肾脏纤维化的信号转导机制提供一定的研究基础,为肾脏纤维化或CKD患者提供一种新的可能的治疗策略和靶点。研究内容与结果一、明确GPR87在肾脏间质纤维化中的表达模式我们收集了不同CKD患者的肾活检病理切片样本,首先通过IHC检测切片中GPR87的表达情况,并将患者肾脏中GPR87阳性表达率与肾小球滤过率进行相关性分析。结果显示与对照组相比,CKD患者的肾活检组织中,GPR87的表达显著增强,且GPR87在肾脏中的表达与eGFR呈负相关。进一步通过免疫荧光双标染色发现,GRP87在肾脏中的表达主要定位近曲小管,在成纤维细胞中表达量较低且无明显定位。以上结果表明GRP87可能在慢性肾脏病的进展中发挥关键作用。体内实验中,通过RT-qPCR、WB和IHC检测UUO、AAN以及DN几个不同肾脏纤维化模型小鼠肾脏中GPR87的表达变化发现,GPR87表达均显著上调。体外实验中,TGF-β1处理HK-2细胞后,WB检测发现细胞中GPR87的蛋白表达水平显著提高。以上结果提示我们GPR87可能特异性参与肾脏间质纤维化并发挥重要作用二、探究GPR87在肾脏间质纤维化中的作用我们构建了 GPR87全身敲除（Gpr87-/-）小鼠以及GPR87肾小管特异性敲除（Cre+/Gpr8 7fl/fl）小鼠,并通过琼脂糖凝胶鉴定基因型。RT-qPCR结果显示Gpr87-/-小鼠肾皮质中GPR87表达明显降低,RT-qPCR和WB结果显示Cre+/Gpr87fl/fl小鼠肾小管细胞中GPR87表达明显降低,证明GPR87基因成功敲除。体内实验中,PAS、Siriusred和MTS染色结果显示,全身敲除及肾小管特异性敲除GPR87均能够明显改善UUO小鼠肾小管萎缩及胶原纤维的沉积,改善肾脏纤维化水平。分子水平上,WB和IHC结果显示,GPR87基因的缺失明显减少了 UUO小鼠肾脏中FN1、Vimentin、α-SMA和CollagenⅠ的上调。体外实验证明,沉默GPR87能够明显改善TGF-β1处理引起的HK-2细胞中FN1、Vimentin和α-SMA的上调。三、探索GPR87促进肾小管糖酵解和线粒体损伤的作用机制体外实验中,seahorse结果显示,沉默GPR87降低了 TGF-β1诱导的HK-2细胞中糖酵解的增强。且WB结果显示,糖酵解抑制剂2-DG降低了 TGF-β1诱导的HK-2细胞中FN1、α-SMA和PGC-1α的升高,但沉默GPR87并不能进一步降低蛋白的表达。乳酸是糖酵解代谢的终产物,而沉默GPR87降低了 TGF-β1诱导的HK-2细胞培养液中乳酸水平的升高。同时WB结果显示,沉默GPR87的HK-2细胞的培养液所处理的NRK-49F细胞中,α-SMA、Vimentin和FN1的表达显著减少。体内实验中,RNA-seq技术分析各模型组间差异表达基因发现,Gpr87-/-鼠UUO模型中,多种糖酵解酶发生改变,其中己糖激酶-2改变最为显著。WB和IHC进一步验证,GPR87的全身敲除以及肾小管特异性敲除均显著降低UUO小鼠肾脏中己糖激酶-2的升高。且WB显示沉默GPR87降低TGF-β1诱导的HK-2细胞中己糖激酶-2的升高。MTS结果显示,在正常小鼠中,己糖激酶-2抑制剂3-BrPA治疗显著减轻UUO小鼠肾脏胶原纤维的沉积,但在Cre+/Gpr87fl/fl小鼠中,3-BrPA的治疗并不能进一步抑制UUO小鼠的肾脏纤维化。体外实验中,MitoTracker和JC-1染色显示,TGF-β1处理使HK-2细胞的线粒体的长度明显减少,膜电位明显降低,结构的完整性遭到破坏,且GPR87过表达加剧了这一现象,3-BrPA处理则逆转GPR87诱导的线粒体损伤。WB结果显示,3-BrPA处理恢复了 GPR87诱导HK-2细胞中PGC-1α的降低。DHE和MitoSOX染色显示,TGF-β1处理使HK-2细胞内ROS和线粒体ROS产生增多,且GPR87过表达加剧了这一现象,3-BrPA处理减弱了 GPR87诱导的ROS的产生。体内实验中,WB以及DHE染色结果显示,GPR87缺失恢复了 UUO小鼠肾皮质中OXPHOS蛋白复合物、PGC-1α、MFN2和TFAM的降低,减少了 UUO小鼠肾脏中ROS的积累。而3-BrPA处理显著恢复正常小鼠UUO肾脏中PGC-1α、MFN2和TFAM的表达降低和ROS的积累,但是3-BrPA处理并没有进一步改善UUO诱导的Cre+/Gpr87fl/fl小鼠的线粒体损伤。WB和IHC结果显示,YAP在UUO小鼠肾脏中的表达明显升高,GPR87缺失显著降低其升高。体外实验中,WB和IF结果显示,沉默GPR87明显改善TGF-β1刺激诱导HK-2细胞中YAP的表达上调。WB、乳酸检测以及DHE和MitoSOX染色结果显示,GPR87过表达进一步增强了 TGF-β1诱导HK-2细胞中己糖激酶-2的升高,PGC-1α的减少,ROS累积,FN1、Vimentin和α-SMA的表达升高以及细胞培养液中乳酸水平的升高。而这些现象均可以被沉默YAP所缓解。研究结论1、GPR87在CKD患者肾脏中明显升高,且主要定位于小管区域;在不同的肾脏纤维化模型小鼠肾脏中表达均显著增强。提示GPR87是慢性肾病进展过程中的关键分子,并且特异性参与肾脏间质纤维化。2、我们的研究首次揭示了肾小管特异性敲除GPR87明显改善UUO诱导的肾脏质纤维化,提示GPR87可能是肾小管细胞损伤的关键靶点。3、我们的研究首次证明了 GPR87-己糖激酶-2信号能够促进肾小管上皮细胞的糖酵解和线粒体损伤。4、GPR87能够调节YAP信号,至少部分地通过YAP-己糖激酶-2信号通路加速糖酵解和线粒体损伤从而促进肾小管间质纤维化,提示靶向GPR87可能是CKD患者的一种新的治疗策略。