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目的:外伤、感染、先天性遗传病等原因可导致角膜内皮细胞发生不可逆损伤，定向诱导胚胎干细胞向角膜内皮细胞进行分化，对治疗角膜内皮相关疾病及重建组织工程角膜具有重要临床意义。目前国内外已有研究表明，利用小分子化合物或基因重编程方法，可诱导胚胎干细胞分化为角膜内皮样细胞，但诱导内皮细胞的效率仍不理想，诱导方案有待进一步改善。本研究旨在利用人胚胎干细胞的多向分化潜能特性，探索新的诱导方法促使人胚胎干细胞向人角膜内皮样细胞分化。 方法:利用AggreWellTM板将人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)制备成具有向三个胚层分化潜能的拟胚体（embryonic bodies，EBs），将EBs转移至超低吸附六孔板中进行3D培养，加入维甲酸(retinoid acid，RA)促使EBs向神经嵴细胞(neural crest cells，NCCs)方向分化，之后接种于包被了硫酸软骨素、层粘连蛋白及纤粘连蛋白的六孔板中，更换为人角膜基质细胞条件培养基（贴壁培养第一阶段诱导分化培养基）培养3天，使其分化为眼周间充质前体细胞（periocular mesenchymal precursors，POMPs），而后更换培养基为人角膜内皮细胞分化培养基（贴壁培养第二阶段诱导分化培养基）继续培养4-12天，使其进一步分化为人角膜内皮样细胞。利用免疫荧光染色方法检测POMPs相关标记物FOXC1和PITX2，以及角膜内皮细胞分化标记物Na+/Ka+ATP酶（Na+/Ka+ATPase），N型钙黏素(N-cadherin)，波形蛋白(Vimentin)，紧密连接蛋白(ZO-1)等。流式细胞仪检测Vimentin阳性细胞比例，Western blotting方法检测HCEC标志蛋白Na+/Ka+ATP酶的表达，证实目的细胞具有角膜内皮样特性。 结果:EBs经RA处理后，更换第一阶段诱导分化培养基进行贴壁培养，观察细胞形态，可见大量梭形细胞自EBs中向周边迁出，NCCs相关标记物呈阳性;第一阶段诱导分化3d后，免疫荧光染色结果显示大部分细胞对POMPs相关标记物PITX2及FOXC1呈阳性表达。更换贴壁培养第二阶段诱导的条件培养基对细胞进行诱导分化4d后可见EBs周边出现少量紧密排列的六边形细胞，细胞数量随培养天数逐渐增加，8d后可见EBs周边出现大量与人角膜内皮细胞（humancorneal endothelial cells，HCEC)形态一致的六边形细胞;在第二阶段诱导细胞的8d，进行细胞内HCEC相关标记物N-cadherin，Na+/K+-ATP酶，ZO-1及Vimentin的免疫荧光染色，部分细胞对以上四种标记物均表达阳性结果;分别在第二阶段诱导分化的4d、8d及12d对细胞进行流式细胞仪进行Vimentin检测，结果显示细胞对Vimentin的表达在第二阶段诱导的8d达到峰值。采用Western blot方法检测Na+/K+-ATP酶，其结果显示细胞在第二阶段诱导分化的8d，表达目标蛋白的阳性细胞达到峰值，与流式检测结果一致。 结论:本研究通过小分子化合物与条件培养基联合、三维与二维培养相结合的方法，成功将hESCs诱导分化为人角膜内皮样细胞，根据免疫荧光染色结果，该角膜内皮样细胞可同时表达HCEC相关标记物N-cadherin，Na+/K+-ATP酶，ZO-1及Vimentin，流式细胞检测显示HCEC标志物阳性细胞率超过40％，为之后构建组织工程角膜、角膜内皮相关疾病的临床治疗提供了细胞来源。