论文部分内容阅读
目的:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是以中枢神经系统(central nervous system,CNS)白质脱髓鞘病变为特点的自身免疫性疾病,具有反复发作的特点。由于MS发病率较高,呈慢性病程且倾向于青年人罹患,使其成为重要的神经系统疾病之一。由于可从MS病人得到的资料有限,因此建立理想的动物模型是进一步研究MS发病机制及治疗的前提和基础。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是一种以中枢神经系统内小血管周围单个核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病,是研究人类脱髓鞘疾病MS的理想动物模型。传统的EAE模型是以脊髓匀浆为抗原免疫大鼠而建立的,但其抗原成分复杂,限制了EAE细胞分子水平的研究,为探索抗原剂量及成分与EAE的关系,本实验首先尝试以小剂量豚鼠脊髓匀浆(guinea pig spinal cord homogenate,GPSCH)建立Wistar大鼠EAE模型,为进一步明确脊髓中具体抗原成分的致脑炎作用及其量的大小与EAE的关系,本研究又以髓鞘碱性蛋白片段MBP69-85 (myelin basic protein,MBP)作为单一成分抗原建立起EAE动物模型。方法:1完全免疫抗原的制备:1.1豚鼠脊髓匀浆免疫抗原的制备取脊髓全长并称重,按脊髓重量与冰盐水体积为1:1、1:5、1:10三种比例制成豚鼠脊髓匀浆,再与等量完全福氏佐剂充分混合,抽打制成油包水乳剂,即为完全免疫抗原。1.2 MBP69-85免疫抗原的制备MBP69-85以冰盐水溶解,再与等体积完全福氏佐剂充分混合、抽打制成乳剂,即为完全免疫抗原。2实验动物分组及EAE模型诱导2.1 GPSCH-EAE实验组:Wistar大鼠60只,随机均分为3组,分别以上述三种不同浓度脊髓匀浆抗原免疫,0.5ml/只,分别于四肢足垫及背部五点皮下注射。对照组:Wistar大鼠10只,以完全福氏佐剂同法免疫。2.2 MBP69-85-EAE实验组:Wistar大鼠60只,随机均分3组,分别以MBP69-85 25μg/只、MBP69-85 50μg/只、MBP69-85 100μg/只进行免疫,按免疫乳剂0.5 mL/只分别于四肢足垫及背部五点皮下注射。对照组:Wistar大鼠10只,以完全福氏佐剂同法免疫。3神经功能评分:于免疫诱导当日及免疫后每天对动物的体重变化、精神状态、活动情况进行观察,并对动物进行神经功能评分,采用Kono等提出的标准,分为5分:1分动物尾部无力;2分尾部无力+肢体无力;3分肢体轻度麻痹;4分级肢体严重麻痹,被动翻身后不能复原;5分濒死状态。4组织病理学:各组大鼠均于免疫后50天内按照发病、缓解、复发三个时期,以10%水合氯醛腹腔麻醉,生理盐水及4%多聚甲醛(或多聚甲醛与戊二醛的混合液)经左心室灌注固定,留取大脑(视交叉层面2mm脑组织),小脑,延髓,颈膨大,腰膨大标本,后固定于4%多聚甲醛中,常规石蜡包埋,6μm切片,组织切片行HE染色,三色染色及髓鞘碱性蛋白MBP、神经微丝NF (neurofilament, NF)免疫组化染色。制备超薄切片,电镜观察髓鞘及轴索病理变化。结果:1匀浆抗原-EAE实验1.1匀浆的抗原1:1组1.1.1 EAE大鼠的发病及临床表现:大鼠的发病率为60%,平均临床症状评分为3.25±0.63,平均发病时间为14.25±1.66天,复发率为33.3%(1/3)。EAE大鼠于免疫后第12天开始发病,出现尾部肌张力减低、尾部无力,继之出现后肢、进而四肢无力、麻痹,大小便失禁,少数表现为仅双前肢的无力或因病情危重而死亡。对照组大鼠没有发病。1.1.2组织病理学检查:1.1.2.1 HE染色见:发病期,中枢神经系统灰质内有单核、淋巴样细胞弥漫或成簇浸润,在脊髓灰、白质交界区内小血管周围可见由较多炎性细胞聚集形成典型血管“袖套样”改变;症状缓解期,血管周围浸润细胞减少或消失;疾病复发期,血管周围细胞增多,白、灰质内细胞浸润明显。1.1.2.2三色染色可见轴突肿胀,呈串珠状,且不连续,着色不均匀;髓鞘结构层次紊乱,疏松,崩解;1.1.2.3 MBP及NF免疫组化染色显示病变组织内白质脱髓鞘及轴突损伤。1.1.2.4电镜观察:发病期病理改变以髓鞘损伤为主,轴突肿胀、疏松;缓解期,受损髓鞘与相对完整髓鞘并存,轴突内结构模糊;复发期,轴突病变严重,空泡变甚至轴突消失。1.2匀浆抗原1:5组1.2.1 EAE大鼠的发病及临床表现:EAE组大鼠的发病率为70%,平均临床症状评分为1.68±0.93,平均发病时间16.07±4.25天,复发率为35.71%。EAE组大鼠于免疫后第12天开始发病,出现尾部无力,继之出现后肢、四肢无力或麻痹,大小便失禁,少数表现为仅双前肢的无力或瘫痪以及斜颈、痉挛状态等特殊类型临床表现或因病情危重而死亡。对照组大鼠没有发病。1.2.2组织病理学检查:1.2.2.1 HE染色见:发病期,中枢神经系统灰质内有单核、淋巴样细胞弥漫或成簇浸润,在脊髓灰、白质交界区内小血管周围可见由较多炎性细胞聚集形成典型血管“袖套样”改变;症状缓解期,血管周围浸润细胞减少或消失;疾病复发期,血管周围细胞增加,灰、白质内细胞浸润明显。1.2.2.2三色染色可见轴突肿胀,呈串珠状,且不连续,着色不均匀;髓鞘结构层次紊乱,疏松,崩解。1.2.2.3 MBP及NF免疫组化染色显示病变组织内白质脱髓鞘及轴突损伤。1.2.2.4电镜观察:发病期病理改变以髓鞘损伤为主,轴突肿胀、疏松;缓解期,受损髓鞘与相对完整髓鞘并存,轴突内结构模糊;复发期,轴突病变严重,空泡变甚至轴突消失。1.3匀浆抗原1:10组1.3.1 EAE大鼠的发病及临床表现:EAE组大鼠的发病率为50%,平均临床症状评分为2.45±1.23,平均发病时间19.20±6.48天,复发率50%;EAE大鼠于免疫后第13开始发病,出现尾部无力,后肢、四肢无力、麻痹,大小便失禁,少数表现为仅双前肢的无力或瘫痪以及斜颈、痉挛状态或因病情危重而死亡。对照组大鼠没有发病。1.3.2组织病理学检查:1.3.2.1 HE染色见:发病期,中枢神经系统灰质内有单核、淋巴样细胞弥漫或成簇浸润,在脊髓灰、白质交界区内小血管周围可见由较多炎性细胞聚集形成典型血管“袖套样”改变;症状缓解期,血管周围浸润细胞减少或消失;疾病复发期,血管周围细胞增加,灰、白质内细胞浸润明显。1.3.2.2三色染色见:轴突肿胀,呈串珠状,且不连续,着色不均匀;髓鞘结构层次紊乱,疏松,崩解。1.3.2.3 MBP及NF免疫组化染色显示病变组织内白质脱髓鞘及轴突损伤。1.3.2.4电镜观察:发病期病理改变以髓鞘破坏为主,轴突肿胀、疏松;缓解期,损伤髓鞘与相对完整髓鞘并存,轴突内结构模糊;复发期,轴突病变严重,空泡变甚至轴突消失。2 MBP69-85-EAE实验2.1 EAE模型动物的发病及临床表现MBP69-85 50μg/只组内大鼠发病率为30%,平均临床症状评分为2.38±1.89;平均发病时间为13.83±1.47天,至处死时未再有复发。EAE大鼠在免疫后第12天发病,出现尾部张力减低、尾部无力,继之出现后肢、进而四肢无力、麻痹,大小便失禁,或表现为斜颈(占发病大鼠的1/3)、因病情危重而死亡,其余各组未见发病。2.2组织病理学观察:2.2.1 HE染色EAE模型组急性发病期中枢神经系统灰质内有单核、淋巴样细胞弥漫或成簇浸润,在脑或脊髓灰、白质交界区内小血管周围可见由较多炎性细胞聚集形成典型血管“袖套样”改变。2.2.2三色染色可见轴突肿胀,呈串珠状,且不连续,着色不均匀;髓鞘“板层样”结构层次紊乱,疏松,崩解。2.2.3 MBP及NF免疫组化染色显示病变组织内白质脱髓鞘及轴突损伤。结论:1 EAE大鼠的发病在一定程度上不依赖于免疫抗原量的大小,在某一合适剂量范围内的抗原均可诱导实验动物发病。EAE动物的发病表现具有多样性和特异性,据神经系统受损部位的不同而出现不同的表现。2 EAE动物的临床表现与其病理改变并不一致,提示神经功能可能存在多种代偿的机制。在EAE动物首次发病时,髓鞘病理改变的严重程度与免疫抗原的剂量有关系。在EAE的病理改变过程中,髓鞘破坏与髓鞘再生并存,而轴突病变是一个持续进展、逐渐加重的过程。3 MBP69-85含有特异性致炎因子,具有致脑脊髓炎作用。EAE模型建立与免疫抗原MBP69-85的量有一定的依赖关系,需要要合适剂量的免疫抗原触发适当强度的自身免疫反应才可使EAE大鼠发病。4病理研究显示病变组织内白质脱髓鞘及轴突损伤,与MS病理改变一致,提示本模型可以作为研究多发性硬化的可靠动物模型,为进一步进行细胞分子水平的研究奠定基础。