慢性牙周炎（chronic periodontitis,CP）是常见的人类口腔疾病之一。牙周炎的发生发展受到多种因素的影响。近年研究表明,牙周炎发生是由于牙周局部免疫防御机制的抑制而使得牙周致病菌定植、繁殖,所产生的多种毒力因子可诱导宿主细胞释放多种前炎性细胞因子或化学介质,从而致使局部的细胞毒性和免疫病理变化,导致牙周组织破坏。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）是目前公认的可疑牙周致病菌之一。该菌可产生一系列逃避宿主免疫防御机制和破坏宿主组织的毒力因子,如脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）、菌毛蛋白A（fimbria protein A,FimA）、胶原酶、牙龈素、凝集素和超氧化物歧化酶等。菌毛是Pg的重要毒力因子之一,与Pg黏附于宿主细胞的能力密切相关。不同fimA基因型的Pg菌株诱导牙周组织细胞产生的炎症反应有所不同。但I型FimA蛋白诱导炎症反应的能力,及在牙周炎发病中的作用目前仍有争议。胶原酶在牙周组织破坏和牙周炎病程进展中有重要的作用。Pg可产生胶原酶,但研究表明Pg胶原酶编码基因prtC表达产物的结构和功能特点具有特殊性。而目前对prtC基因产物的研究都集中在胶原酶活性上,PrtC诱导宿主细胞炎性细胞因子表达的作用尚未见报道。如PrtC具有直接诱导炎症反应的作用,则可能与真正的胶原酶或宿主来源的胶原酶起协同作用而在牙周组织破坏中发挥作用。LPS是Pg产生的另一重要致炎因子,可诱导宿主细胞产生前列腺素E₂（prostaglandin E₂,PGE₂）。PGE₂来自于花生四烯酸,后者经多种酶催化而生成PGE₂,包括磷脂酶A₂,环加氧酶及一些末端前列腺素E合成酶。有研究证实,Pg-LPS的结构具有特殊性,所诱导的宿主细胞炎症反应与大肠杆菌脂多糖（lippopolysacchride of Escherichia coli,E-LPS）有所不同。目前对LPS诱导PGE₂合成通路的研究多采用E-LPS,Pg-LPS在诱导PGE₂合成通路上是否具有不同于E-LPS的特点尚不得而知。本研究的目的是:①了解PgI型FimA和PrtC蛋白的体内体外致炎作用;②观察Pg-LPS作用下细胞花生四烯酸和PGE₂释放水平的变化,及对PGE₂合成通路中关键酶的mRNA和蛋白表达水平的影响,并探讨相关的信号调控通路。上述问题的阐明有助于进一步理解Pg在牙周炎发病和病程进展中的作用。主要研究内容和结果如下:第一部分牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白A和胶原酶在慢性牙周炎患者龈下菌斑中的水平及其诱导人脐静脉内皮细胞ECV304株炎性细胞因子表达的作用实验一、构建pET-32a-fimA BL21DE3和pET-32a-prtC BL21DE3原核表达系统,用Ni-NTA亲和层析纯化重组蛋白。以纯化的重组蛋白和Pg全菌免疫家兔后获得抗血清,并用Western blot检测rFimA和rPrtC的免疫反应性和免疫原性。结果发现:所克隆的fimA和prtC基因测序结果与已报道的核苷酸及推测氨基酸序列比较（GenBank:D17795,AB006973）,其同源性在98.5%-99.7%之间。所构建的表达载体pET-32a-fimA和pET-32a-prtC经双酶切和琼脂糖凝胶电泳后,在预期位置上可见目的条带,核苷酸序列测定结果证实了插入的目的基因序列和方向正确。纯化后的rFimA和rPrtC,在SDS-PAGE上各目的重组蛋白均仅见单一的条带。Western blot结果表明,rFimA和rPrtC能与其诱导家兔产生的相应抗体结合,也能与兔抗Pg全菌抗血清结合,提示rFimA和rPrtC有良好的免疫原性和免疫反应性。实验二、以所制备的兔抗rFimA或rPrtC抗血清为一抗,建立检测龈下菌斑标本中的FimA和PrtC水平的ELISA方法,对49例慢性牙周炎患者和25名牙周健康者的共221份龈下标本中的FimA和PrtC水平进行了检测,并分析了其与牙周临床指数间的关系。结果发现:①CP患者龈下菌斑标本中的FimA和PrtC水平显著高于牙周健康者（P＜0.05）。②牙周基础治疗后患者标本中的FimA和PrtC水平明显降低。③龈下菌斑标本中的FimA水平主要与探诊出血有关,而PrtC与探诊出血、附着丧失和探诊深度均有关。提示:CP患者龈下菌斑中的FimA水平主要与牙周炎症有关,而PrtC水平与牙周炎症和组织破坏均有关。实验三、用rFimA和rPrtC蛋白作用于人脐静脉内皮细胞来源的ECV304株,用ELISA试剂盒检测其诱导炎性细胞因子IL-1α、IL-8、TNF-α和ICAM-1分泌的作用。结果发现:①1、5和10μg的rFimA在作用较长时间（48h）后,才可观察到IL-1α水平的增高（P＜0.05）。而三种浓度的rFimA作用12h后ICAM-1水平即有明显增高,至24h时达到峰值,48h有所下降,但仍明显高于阴性对照（P＜0.05）。rFimA对IL-8和TNF-α水平无明显影响（P＞0.05）。②1μg的rPrtC作用24h、5和10μg的rPrtC作用12、24和48h均可明显促进ECV304合成并分泌IL-1α、IL-8和TNF-α（P＜0.05）。其中IL-1α在作用24h时达峰值,IL-8和TNF-α则随作用时间延长而逐渐升高。rPrtC对ICAM-1的分泌无影响（P＞0.05）。结论:1.重组I型FimA蛋白有较强的诱导内皮细胞分泌细胞间黏附因子的作用,可能与Pg相关的牙周炎症和某些全身疾病的发生有关。2.重组PrtC蛋白有较强的刺激内皮细胞分泌炎性细胞因子的作用,其在牙周组织破坏中的作用可能是通过对宿主细胞的致炎效应来实现的。第二部分牙龈卟啉单胞菌脂多糖对人单核细胞THP-1株PGE₂合成通路的影响实验一、采用改良的热酚-水法从Pg ATCC 33277株中提取Pg-LPS,并获得纯化后的精制品。用鲎试验检测Pg-LPS的生物活性。结果表明:所提取的Pg-LPS具有较高的生物活性（≧15.0ng/ml）,可用于后续试验。实验二、以人单核细胞THP-1株为效应细胞,分别用Pg-LPS和商品化大肠杆菌O111:B4株的脂多糖刺激后,用酶免疫试剂盒检测PGE₂。结果发现:①1μg/ml的E-LPS作用1-48h可使PGE₂水平持续增高;而相同浓度的Pg-LPS作用6h后才出现PGE₂的增高,作用24h后达峰值,48h略有下降。②相同浓度的E-LPS和Pg-LPS所诱导产生的PGE₂水平不同,E-LPS的作用明显强于Pg-LPS（P＜0.05）。实验三、采用[³H]标记的花生四烯酸掺入的方法,用液闪计数法观察E-LPS和Pg-LPS作用前后花生四烯酸释放水平的变化。结果发现:①E-LPS作用1-6h可见[³H]AA的CPM值增高,最高为2h时;而Pg-LPS作用4-6h后有[³H]AA水平增高,最高为6h时。②E-LPS诱导的[³H]AA CPM峰值明显高于Pg-LPS（P＜0.05）。实验四、用RT-PCR法检测Pg-LPS和E-LPS对胞浆磷脂酶A₂（cytosolicphospholipase A₂,cPLA₂）、环加氧酶2（cyclooxygenase-2,COX-2）和膜结合前列腺素E₂合成酶1（membrane-bound form of prostaglandin E₂ synthase-1,mPGES-1）的mRNA转录水平的影响。结果发现:①E-LPS作用1h后THP-1细胞的cPLA₂的mRNA水平开始增高,2-6h后其条带显著强于blank对照:而Pg-LPS作用4-6h后才有cPLA₂转录的增强。②在E-LPS作用1-16h后或Pg-LPS作用6-16h后,COX-2转录增强。③mPGES-1的mRNA水平的增高则在E-LPS作用4-24h或Pg-LPS作用6-24h后出现。实验五、用Western blot方法检测Pg-LPS和E-LPS作用前后,cPLA₂、COX-2和mPGES-1的蛋白表达情况的变化。结果发现:①E-LPS作用1h后THP-1细胞的cPLA₂蛋白的表达开始增高,4h后其条带明显强于空白对照;Pg-LPS作用4h后cPLA₂蛋白的条带也有所增强;在两者作用8h后cPLA₂蛋白表达水平恢复到基线水平。②在E-LPS作用4-16h后或Pg-LPS作用8-16h后出现COX-2蛋白的表达,最强的条带出现在E-LPS作用8h和Pg-LPS作用16h时。③在E-LPS作用4-24h后或Pg-LPS作用8-24h后出现mPGES-1蛋白的表达,其峰值均在16h时。实验六、应用多种特异性阻断剂预处理后,再用Pg-LPS和E-LPS作用于THP-1细胞,检测PGE₂、花生四烯酸释放水平、cPLA₂、COX-2和mPGES-1表达情况的变化,包括ERK通路阻断剂PD98059、P38 MAPK通路阻断剂SB203580、JNK通路阻断剂SP600125、cPLA₂抑制剂AACOCF3、磷脂酶C（phospholipase C,PLC）抑制剂U73122、磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol3-kinase,PI3-K）通路阻断剂LY294002、COX-2抑制剂NS-398和NF-κB信号通路阻断剂SN50。结果发现:①E-LPS和Pg-LPS诱导的PGE₂水平的增高,COX-2和mPGES-1 mRNA转录的增强和蛋白表达水平的增高均可被PD98059、SB203580、SP600125和SN50部分或完全抑制,LY294002也有较弱的抑制作用,而U73122和AACOCF3作用后则无明显抑制作用。②E-LPS和Pg-LPS诱导的花生四烯酸释放水平的增高和cPLA₂的mRNA转录增强和蛋白表达增高可被PD98059、SB203580、AACOCF3、U73122、LY294002和SN50抑制,而SP600125和NS-398对其无影响。③NS-398可有效地抑制COX-2的转录和表达。结论:1.与E-LPS相比,在THP-1细胞中Pg-LPS对PGE₂合成通路影响的效应时间延后且作用较弱。2.E-LPS和Pg-LPS作用下PGE₂合成的调控信号通路是相似的,主要与ERK、P38、JNK三条MAPK信号通路和NF-κB信号通路有关,也可能受PI3-K通路的影响。3.E-LPS和Pg-LPS作用下PGE₂的合成可能主要是由于LPS激活多种信号通路而使相偶联的COX-2和mPGES-1表达增高,而促进了PGE₂的生成,而与cPLA₂的关系不大。