甘油二酯是甘油上的两个羟基与两分子的脂肪酸酯化得到的产物,包括1,2-甘油二酯和1,3-甘油二酯两种形式。其中,富含1,3-甘油二酯的油脂具有防止肥胖、降血脂、降血压等多种生理功能,因而被认为是“特定健康用食品”。同时,1,3-甘油二酯又是合成一些化合物(如结构脂1,3-二油酰基-2-棕榈酰甘油酯等)的重要原料。由于天然油脂中1,3-甘油二酯的含量很低,所以其催化合成的研究显得尤为重要。在生物催化制备1,3-甘油二酯的研究中,往往由于酶的选择性、酶活力、反应程度和分离纯化等方面存在一定的缺陷,导致产品中1,3-甘油二酯的含量较低,这严重影响了产品的广泛应用。酰基迁移现象普遍存在于甘油二酯的制备和储存中。本论文首先研究了 1,3-甘油二酯在不同温度下的酰基迁移情况,初步确定酶法制备1,3-甘油二酯的温度为30℃。在此温度下,研究了不同脂肪酶的区域选择性,获得在催化油酸与甘油的酯化反应中具有最高的1,3-区域选择性的脂肪酶ROL(Rhizopus oryzaelipase),其对1,3-甘油二酯的选择性>97%。为强化脂肪酶ROL在油酸与甘油的酯化反应体系中的催化性能和重复利用性能,设计并制备了粒径为15-20 nm的磁性纳米Fe3O4。通过硅烷偶联剂APTES和戊二醛的修饰,获得了表面带有醛基的磁性颗粒,并用于脂肪酶ROL的固定化。借助于表面活性剂蔗糖酯SE-11的界面激活效应,固定化脂肪酶的活力得到了大幅度的提高。在以p-NPB和p-NPP为底物时,其水解活性分别为游离酶的9.16倍和31.6倍。在此基础上,在1L的连续搅拌反应器中对纳米四氧化三铁固定化ROL催化的油酸与甘油的酯化反应进行了优化。当反应温度为30℃,反应体系真空度保持在500Pa以内,搅拌速度控制在400rpm,油酸与甘油的摩尔比为2.8:1,固定化酶的加入量为8‰(w/w)时,反应8h后产物中甘油单酯的含量小于3%(w/w),1,3-二油酸甘油酯的含量在76%(w/w)左右。固定化酶重复利用55批后剩余约75%的活力。经过NaOH或者Na2CO3的皂化反应,除去过量的油酸,获得了纯度大于95%(w/w)的1,3-甘油二酯,产品回收率达到85%(w/w)。为了简化脂肪酶ROL的获取和改造过程,在毕赤酵母GS115中实现了其异源表达。考察了前导肽对其表达量和选择性的影响,发现带有前导肽基因的重组子在诱导96h时,发酵液中的酶活力达到了 311 U/ml,约为不带前导肽基因的重组子的2倍,且前者的1,3-区域选择性优于后者,Re%分别为>97%和92%。由于脂肪酶ROL的热稳定性较差,为拓宽其应用范围,对其进行了热稳定性改造。基于多序列比对结果,获得了两株热稳定性明显提高的突变体,分别为V209L和D262G(在55℃下的半衰期分别是原始酶的4.38和4.2倍)。其中209位的突变导致酶分子内氢键键长的减小,而262位引入甘氨酸,减轻了构象应变并消除了不利的空间相互作用,从而增强了蛋白质的热稳定性。借助在线设计网站DbD2的帮助,在ROL中引入了新的二硫键(E190C/E238C),得到的突变体在60和65℃下的半衰期达到了原始酶的72.4和8.33倍。通过组合突变,获得四点突变体V209L/D262G/E190C/E238C,其在65℃下的半衰期达到了原始酶的20倍。同时,四点突变体对底物p-NPB的水解活力保持了与原始酶相当的水平。在成功实现酶的热稳定性改造后,通过增加其在毕赤酵母中的基因拷贝数,提高了其表达水平,3个拷贝的转化子在诱导96h后,酶活达到了 386U/ml,比单拷贝转化子高约25%。用纳米四氧化三铁对重组脂肪酶进行固定化,固定化酶的水解活力回收达到519.8%。该固定化酶在催化多种不同脂肪酸与甘油的酯化反应中,均表现出了优异的性能。进一步,我们尝试通过分子动力学模拟对脂肪酶ROL的选择性作合理的解释。通过分子动力学计算,发现脂肪酶ROL与两种甘油二酯形成酶-底物复合物时,其催化三联体中145Ser上的羟基氧原子与1,3-二油酸甘油酯的sn-1位羰基碳原子之间的距离约为3-3.5A左右,而与1,2-二油酸甘油酯的sn-1位羧基碳原子之间的距离超过5A,与2位羰基碳原子之间的距离达到了 8A;当1-油酸甘油酯与酶形成的复合物经过分子动力学模拟,其羰基碳原子与催化三联体的145Ser上的羟基氧原子之间的距离降至3A左右,小于2-油酸甘油酯的羰基碳原子与145Ser上羟基氧原子之间的距离。该理论较好地解释了脂肪酶ROL具有sn-1,3位区域选择性。