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研究目的黑色素瘤是具有双向分化能力的恶性肿瘤。Maniotis等人在研究黑色素瘤时发现了血管生成拟态（vasculogenic mimicry,VM）现象。VM是肿瘤特有的血液供应模式,VM由肿瘤细胞和PAS阳性物质围成的管腔,内含红细胞。本课题组在大量的临床组织标本的观察中发现了线性程序性坏死（linearly patterned programmed cell necrosis,LPPCN）这一特殊的细胞死亡模式。LPPCN是肿瘤细胞群体主动发生的、没有炎症细胞浸润的死亡模式。前期实验结果证实LPPCN的存在促进VM的形成,其消亡而残留的空间可能为血管生成拟态和内皮依赖性血管（endothelium dependent vessel,EDV）的形成提供空间结构基础。本课题收集135例黑色素瘤组织标本,探讨黑色素瘤中LPPCN、VM的现象及其形成机制。研究方法1.收集135例人黑色素瘤组织标本,运用HE染色及、CD34/PAS双重染色、c-myc的表达情况方法分别检测黑色素瘤组织中LPPCN和VM的情况,并初步分析其与黑色素瘤患者临床病理参数、患者生存预后的关系。2.运用MTT增殖实验,Matrigel三维培养,侵袭、迁移实验,划痕实验,分别检测c-myc对黑色素瘤细胞增殖能力,管道形成能力,侵袭、迁移能力,伤口愈合能力的影响。运用Western Blot,RT-PCR,荧光素酶报告基因和免疫共沉淀方法等方法检测c-myc转染效果及其对Snail,VE-cadherin蛋白表达的影响。3.运用Annexin V-FITC/Propidium Iodid凋亡实验和流式细胞术,检测c-myc对黑色素瘤细胞的促凋亡作用。并使用Western Blot,si RNA实验检测c-myc对凋亡相关蛋白Bcl2、Bax的影响。4.利用不同浓度Cocl2体外模拟细胞的梯度缺氧。使用RT-PCR和Western Blot检测各细胞中HIF-1α、Bcl2、Bax基因及蛋白表达变化,并观察Bcl2/Bax比值的变化。5.运用裸鼠动物模型,再次验证c-myc对黑色素瘤的作用。运用HE染色、Endomucin/PAS双染检测移植瘤内c-myc对LPPCN和VM的影响;运用免疫组化方法检测VM、凋亡相关蛋白的表达情况。6.建立细胞球石蜡包埋方法。鼠源黑色素瘤细胞系B16F10细胞球培养,石蜡包埋,HE染色,观察细胞球中程序性坏死现象。B16F10细胞球在C57小鼠体内培养第5天,将移植瘤取出,石蜡包埋。HE染色观察LPPCN生成情况。7.无血清悬浮培养法富集黑色素瘤肿瘤干细胞,琼脂糖悬浮培养黑色素瘤细胞,并石蜡包埋切片HE染色观察两组的区别。Agilent表达谱芯片分析两者基因表达情况,筛选靶基因进行荧光定量PCR验证。8.流式细胞分离术分离高、低表达靶基因的B16F10细胞,Western Blot方法验证分离效果,并检测VM形成相关蛋白E-cadherin、Twist1,VE-cadherin及肿瘤多能干性相关蛋白Sox2、c-myc的表达情况。9.运用Matrigel三维培养,迁移、侵袭实验,划痕实验,检测靶基因对黑色素瘤细胞管道形成能力,侵袭、迁移能力及伤口愈合能力的影响。Western Blot和荧光定量PCR方法检测VM形成相关蛋白E-cadherin、Twist1、Vimentin,VE-cadherin和肿瘤多能干性相关蛋白Sox2、c-myc表达情况。10.使用Notch信号通路抑制剂（γ分泌酶抑制剂DAPT）,并使用Western Blot和荧光定量PCR方法检测靶基因Notch4抑制情况及VM形成相关蛋白表达情况。再次上调稳定降表达Notch4的黑色素瘤细胞的Twist1表达,Western Blot检测E-cadherin和VE-cadherin的表达情况。11.收集120例人黑色素瘤病例,免疫组化方法检测黑色素瘤组织中Notch4蛋白的表达情况,初步分析其与临床病理参数、VM之间的关系。研究结果1.135例人黑色素瘤组织中LPPCN阳性者48.15%,VM阳性者45.93%。两者均与肿瘤的Breslow厚度、远处转移、患者不良预后相关（p<0.05）。人黑色素瘤组织中高表达c-myc者占总数的48.15%。c-myc高表达与肿瘤的Breslow厚度、淋巴结转移、远处转移及患者不良预后相关（p<0.05）。c-myc高表达与VM、LPPCN成正相关（p<0.05）。2.体外功能实验结果显示c-myc高表达增强A375、MUM-2C细胞的增殖,管道形成,侵袭、迁移能力（p<0.05）。c-myc蛋白能够促进黑色素瘤细胞多向分化:促进间质表型Vimentin表达,并通过TGF-β/Snail/E-cadherin信号通路促进黑色素瘤细胞上皮表型丢失;能够结合VE-cadherin启动子并促进其转录,进而促进VM的形成。3.急性或重度缺氧时c-myc蛋白通过上调Bax表达,降低Bcl2/Bax比值,进而促进黑色素瘤细胞凋亡。4.动物模型中,下调c-myc后MUM-2B黑色素瘤移植瘤生长速度减慢,肿瘤体积减少,肿瘤中LPPCN与VM数量减少（p<0.05）,E-cadherin表达上调,VE-cadherin、Bax、HIF-1α表达下降;上调c-myc后MUM-2C黑色素瘤移植瘤肿瘤的生长速度加快,肿瘤体积增加,LPPCN与VM数量增加（p<0.05）,E-cadherin、HIF-1α、Bax表达下降,VE-cadherin、Bcl2表达升高,且Bax阳性表达呈线状排列。5.B16细胞球HE染色发现细胞球呈现三层结构,从内向外依次为坏死或将死细胞层、静止细胞层、增殖细胞层。在细胞球的坏死或将死细胞层中死亡的呈现核深染、浆浓缩、细胞间连接消失的现象。但无线形或网状排列的LPPCN。体内培养第5天。HE染色见无血管长入的移植瘤内有LPPCN样细胞死亡,但无线形或网状排列的LPPCN。6.Agilent表达谱芯片结果显示黑色素瘤干细胞高表达高表达Sox4（NM009238）,Wnt10a（NM009518）,NGFR（NM033217）等肿瘤干细胞相关基因,药物抗性基因ABCA8（NM013851）、ABCA1（NM013454）以及Notch信号通路相关基因:Notch3（NM008716）、Notch4（NM010929）、Dtx4（NM172442）、JAG2（NM010588）和Pofut（NM080463）。荧光定量PCR再次检测上述基因表达情况。结果显示上述10中基因的表达趋势与芯片结果一致,且Notch4和NGFR差异具有统计学意义。7.Western Blot结果显示流式细胞分选出的Notch4highB16F10细胞高表达Notch4、Jagg2、Twist1、VE-cadherin、Sox2蛋白,低表达E-cadherin蛋白。8.Notch4降表达降低A375、MUM-2B细胞的管道形成,侵袭、迁移,伤口愈合能力（p<0.05）。Western Blot和荧光定量PCR结果显示下调Notch4后,VM形成相关蛋白Twist1、Vimentin、VE-cadherin的表达下降,和上皮表型蛋白E-cadherin表达的升高。9.Western Blot结果表明γ分泌酶抑制剂DAPT抑制了Notch4胞内段的解离并下调Twist1表达,同时上调E-cadherin蛋白的表达。再次上调稳定降表达Notch4的黑色素瘤细胞中Twist1表达后,Western Blot结果显示E-cadherin表达降低,VE-cadherin的表达升高。10.120例人黑色素瘤组织中免疫组化结果显示72（60%）例黑色素瘤患者中Notch4高表达。Notch4免疫组化染色定位于黑色素瘤细胞浆。Notch4高表达与患者TNM分期,淋巴结转移,患者不良预后及VM相关（p<0.05）结论1.人体黑色素瘤组织中存在VM和LPPCN现象,且c-myc在人体黑色素瘤组织中高表达,三者均与黑色素瘤的侵袭、转移等恶性生物学行为和不良预后相关。c-myc高表达与LPPCN,VM成正相关。2.c-myc高表达使黑色素瘤细胞上皮表型丢失,间充质表型增强,促进黑色素瘤VM的形成;c-myc高表达促进黑色素瘤细胞LPPCN的发生,进而促进黑色素瘤VM的形成。3.LPPCN的形成与肿瘤血管密切相关。4.Notch4在黑色素瘤干细胞中高表达。Notch4通过下调Twsit1的表达降低黑色素瘤细胞上皮表型,增强间质表型,并促进黑色素瘤迁移、侵袭及三维成管能力。人体组织标本中Notch4高表达与黑色素瘤侵袭、转移,不良预后相关,与VM成正相关。