研究背景原发性肝细胞癌(HCC)是人类常见的恶性肿瘤之一,发病率居恶性肿瘤第5位,特别是在中国发病率位于恶性肿瘤前三位,每年有近600000新增病例。其恶性程度高,是肿瘤相关死亡的第三大原因。外科手术切除和肝脏移植是目前临床应用的治疗手段。但是对于失去手术机会的,术后肝癌复发转移的,目前还没有有效治疗手段,3年生存率(30-40%)较低。肝癌临床转移率高,侵袭和转移是肝癌的显著特征,也是肝癌患者预后差的最重要原因,因此抑制肝癌的侵袭和转移是肝癌治疗的重要策略。进一步研究肝癌细胞侵袭转移的调控和分子机制具有重大科学意义和临床价值。肝细胞癌发生转移机制仍很不明确。现有的肿瘤发生理论,如基因改变,包括原癌基因的激活、基因缺失或突变,端粒酶活性的再活化和表观遗传学异常等,都不能全方位的解释肝细胞癌发展、转移和复发的分子机制。目前研究显示,肿瘤细胞群具有明显异质性,在肿瘤细胞群中,众多细胞呈现出分子生物学或基因方面的明显不一致,从而使肿瘤的生长、对药物的敏感性、侵袭转移能力等各方面产生差异。在同一个体肿瘤细胞群中,根据细胞表面分子标记不同可以分选出几个亚群细胞,分别具有不同的表型。针对肿瘤细胞异质性,对不同表型肿瘤细胞的研究可能成为解释肿瘤许多基础和临床不同特性肿瘤生物学行为的突破口。肿瘤异质性包括肿瘤细胞的形态结构异质性、抗原和免疫原异质性、水解酶异质性,并且具有不同的生物学行为,即功能异质性,如增殖能力、迁移和侵袭能力、对药物敏感性、细胞间相互作用等等的差异。肿瘤细胞群中并不是所有的肿瘤细胞均具有侵袭转移能力,而是存在一小部分细胞,因为某些关键蛋白的异常表达,获得了更强的侵袭能力或抵抗化疗药的能力,这些肿瘤细胞可能就是肿瘤转移或者复发的基础。如果能阐明其分子生物学特征和表型功能之间的关系,就有可能揭开肿瘤侵袭、转移的相关路径。Hedgehog(Hh)信号通路与生物体内细胞的增殖,发育密切相关。正常情况下在生物体胚胎发育,维持成体稳态的过程中发挥重要作用。Hh信号通路中重要的转录因子Gli家族在肿瘤发生和发展中起着关键作用。Gli家族有三个成员:Gli1、Gli2和Gli3。在hh信号通路未激活时,gli1被转录抑制,gli2通过trcp2介导被降解,gli3在体内被剪切成小片段,均不能入核行使转录因子的功能。当sonichedgehog(shh)与细胞膜受体结合活化hh信号通路后,导致gli家族蛋白转位进入细胞核内调控hh通路下游涉及的重要的靶基因。已有文献证实gli1/2参与了一些重要分子的基因调控,比如snail,gli-2,c-myc,白介素2,和周期蛋白d等。tgli是gli1的一种剪切体,由gli1缺失了包括整个外显子3和部分外显子4的123个碱基(41个密码子)产生。通常情况下,tgli1保留了gli1的转录调节功能,可以调节下游靶基因表达,特别是与侵袭转移相关的靶基因。近年来发现hh信号通路在肿瘤发生和发展中也扮演重要角色,已经有文献报道hh信号通路参与多种肿瘤的发生,包括基底细胞癌、直肠癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等。有研究发现hh信号通路的异常激活参与了肝癌的发生和发展,特别是与肝癌细胞的侵袭和转移有密切关系。smo的拮抗剂作为新药已经发展应用于阻断肿瘤生长,正在进行动物实验中。但是,异常活化的hh信号通路调节肝癌细胞侵袭转移的分子机制不清。上皮细胞间质化(emt)是上皮细胞丢失细胞间连接而获得间质细胞特性的生物转化过程,是肿瘤侵袭转移的重要原因。在肿瘤细胞出现emt时,可以视为侵袭转移的开始。在emt过程中的特征性变化包括:下调上皮细胞的标志e-cadherin、β-catenin的核转位聚集,以及上调间质细胞的标志n-cadherin、vimetin等。e-cadherin是上皮细胞的重要粘附分子,是维持上皮细胞表型的重要分子,e-cadherin分子键通过细胞外的免疫球蛋白结构域相互形成链接,并通过胞浆内的α、β-catenin与肌动蛋白骨架相连,从而形成稳定的细胞间接触。肿瘤细胞中e-cadherin表达下调,降低了细胞相互粘合的能力,促进肿瘤细胞从原发灶上脱落,侵入周围组织。研究肝癌异质性,发现高侵袭转移特性肝癌亚群的表型及分子机制,并初步探讨其治疗方法是本实验的主要目的。研究目的本项目拟研究hh信号通路在调控肝癌细胞转移中的作用,探讨其分子机制和作用靶点。评估hh信号通路中关键分子gli1在肝癌的临床治疗和预后判断中的作用。研究结果有助于深入研究肝癌细胞转移的生物学本质,为治疗肝癌转移复发和预后评估提供分子靶点和实验依据。实验方法1.以cd133和epcam作为表面分子标记,流式分选不同表面分子标记的肝癌细胞亚群cd133+/epcam+和cd133-/epcam-,并传代培养亚群细胞。2.检测肝癌各个亚群细胞的肿瘤形成能力、化疗药物敏感性及转移能力,阐述每一亚群的细胞特性。3.应用生物荧光发光显影技术,观察nod-scid小鼠体内原位成瘤实验结果,体内证实筛选的稳定高转移亚群肝癌细胞的转移能力。观察应用hh抑制剂前后移植瘤的转移情况。4.利用transwell实验筛选稳定传代的高转移肝癌细胞亚群,并检测这群细胞的表面分子标记。5.应用荧光素酶实验检测不同细胞亚群的hh信号通路激活状态,并应用抑制剂,证实hh激活能促进肝癌细胞侵袭转移。6.通过免疫荧光双标实验检测不同转移能力的肝癌细胞亚群细胞的emt相关分子e-cadherin和vimetin的定位情况,同时应用qpcr和westernblot检测不同亚群细胞hh信号通路关键蛋白gli1的表达情况。7.通过qpcr和westernblot实验检测高转移亚群细胞emt关键蛋白twist、和snail的mrna和蛋白表达水平。8.实时定量pcr检测各亚群细胞中应用hh信号通路抑制剂前后gli1gli1、twist、snailandmmps的表达变化。9.利用含twist启动子报告质粒,用双荧光素酶实验检测高转移肝癌亚群细胞中干扰gli1前后的相对荧光素酶活性变化。10.在多株肝癌细胞系和正常人肝细胞中用常规逆转录pcr检测gli1剪切体tgli1的表达。实验结果1.利用cd133和epcam作为分子表面标记,从6个肝癌细胞株hep3b,hepg2,huh-7,hle,hlf,skhep1细胞中分选出cd133和epcam双阳性和双阴性细胞亚群。在高分化的hep3b,hepg2,huh-7肝癌细胞株中cd133+/epcam+细胞的阳性率分别为10.3%,2.3%,18.3%;而cd133-/epcam-细胞率分别为15.09%,72.47%,28.81%。在低分化的hle,hlf,skhep1肝癌细胞株中几乎没有双阳性细胞。将分选的细胞培养传代。2.利用transwell实验筛选稳定传代培养的高转移cd133-/epcam-huh-7细胞transselectedcells。3.证实同一肝癌细胞株来源的不同亚群细胞生物学特性不同。肿瘤形成能力:cd133+/epcam+亚群细胞体外成球能力显著强于相对应的cd133-/epcam-亚群细胞(p<0.001)。4.肿瘤细胞亚群药敏试验结果显示,hlecd133-/epcam-经过24小时顺铂,阿霉素和索拉菲尼处理后,其存活率比阳性细胞亚群高,对化疗更不敏感。5.transwell实验发现cd133-/epcam-亚群细胞的侵袭转移能力强于cd133+/epcam+亚群细胞,而经过transwell分选的transselectedcells细胞侵袭转移能力最强。hh信号通路抑制剂lde225可以抑制hu7细胞的转移能力,说明hh信号通路与肝癌转移密切相关。6.huh-7transselected亚群细胞,huh-7untreated细胞成功转染慢病毒载体luc-pgk-egfp。huh-7transselected亚群细胞和huh-7untreated细胞gfp阳性细胞原位接种小鼠肝脏实质内,成功建立移植瘤动物模型。7.活体荧光成像技术观测结果显示,三个月后huh-7transselected亚群细胞移植瘤小鼠肝外转移明显多于huh-7untreated细胞移植瘤小鼠。经过hh信号通路抑制剂lde225处理小鼠以后,转移明显减少。8.运用gli1-lux报告系统检测hh通路信号活性,结果显示cd133-/epcam-亚群细胞中荧光素酶活性比双阳性细胞高。应用hh信号通路拮抗剂,荧光素酶活性下降。9.免疫荧光检测不同转移能力的细胞亚群中emt相关分子e-cadherin和vimentin表达情况。结果显示cd133-/epcam-亚群细胞中e-cadherin表达阳性而vimentin表达呈阴性,而阳性亚群细胞显示相反的结果。说明hh激活的高转移肝癌细胞亚群发生了emt改变。10.qpcr和westernblot实验检测各组细胞亚群中hh信号通路关键蛋白gli1,gli2,twist表达情况,发现huh-7transselected细胞亚群中gli1和twist1表达量最高,应用抑制剂后gli1和twist1表达下降;而snail表达没有明显变化。11.qpcr实验检测各组细胞亚群中mmp1,2,9表达情况,发现huh-7transselected细胞亚群中mmps表达都显著高于双阳性亚群细胞(4294-,74-and36-倍)。12.用双荧光素酶实验检测高转移肝癌亚群细胞中干扰gli1前后的相对荧光素酶活性变化。结果显示gli1在转录水平调控twist1表达。13.常规逆转录pcr检测在多株肝癌细胞株和亚群细胞及正常肝细胞中的gli1剪切体tgli1。结果发现在正常肝细胞和高分化的肝癌细胞株包括hep3b和hepg2肝癌细胞株中不能检测到tgli1的表达,但在低分化的hlf肝癌细胞株和高转移肝癌细胞亚群中tgli1检出阳性。结论1.肝癌细胞的异质性决定了不同细胞亚群生物特性不一样,以cd133和epcam为分子标志筛选的肝癌细胞系中CD133+/EpCAM+亚群细胞具有较强成瘤能力和更高的化疗敏感性,而CD133-/EpCAM-亚群细胞侵袭转移能力明显增强。2.体内体外实验证实异常活化的Hh信号通路导致了CD133-/EpCAM-肝癌细胞亚群具有明显的侵袭转移能力,应用Hh信号通路抑制剂可以抑制高转移亚群细胞的在动物体内的侵袭转移。3.进一步机制研究发现CD133-/EpCAM-高转移肝癌亚群细胞的侵袭转移与Hh信号通路与密切相关,在高转移肝癌亚群细胞中Hh信号通路关键蛋白Gli1调控Twist1表达,进而导致肝癌细胞EMT的发生,促进细胞侵袭转移。此外在该高转移亚群细胞中tGli1的表达也可能是引起其侵袭转移的原因。以上结论阐明了异常活化的Hh信号通路通过Twist1引起肝癌高转移亚群细胞转移的新机制,对低分化肝癌肿瘤患者转移复发的治疗或化学干预提供理论依据。