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糖鞘脂Gb3（Globotriaosylceramide）广泛存在于哺乳动物细胞膜表面，在细胞的生长、分化、识别、信号传导等方面起着非常重要的作用。细胞膜上的Gb3是志贺杆菌毒素（Shiga toxin，STx）的受体，与志贺杆菌引起的中毒性腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒症密切相关。志贺毒素STx是由痢疾志贺菌（Shigella dysenteriae）产生的一种重要的致病毒力因子，由具有酶活性的A亚基（STxA）和受体结合作用的B亚基（STxB）两部分构成。研究表明，在哺乳动物细胞内，STxB与Gb3结合后，经由早期胞内体/循环胞内体直接到达高尔基体，再逆向运输至内质网，而不经过晚期胞内体的降解环境。然而另有研究表明，将荧光标记的Gb3加入细胞后，部分Gb3也到达高尔基体。但现有的一些证据显示，Gb3和其配体STxB可能采取不同的胞吞途径：细胞固有的Gb3途径和由配体STxB诱导产生的STxB途径。
本文以HeLa细胞为实验材料，从两个方面研究了配体结构与配体胞吞途径的关系。第一部分，通过分子克隆构建了三个与Gb3结合强弱不等的STxB突变体，研究并比较了野生型配体和突变配体的胞内运输。第二部分比较了不同配体（天然配体STxB和人工配体Gb3抗体38-13）的胞吞途径，从而阐明STxB在细胞内的运输路径是否由STxB诱导产生的。
第一部分：1.总结文献确定构建三个突变体，分别为W34A、D17E和F30A，。在结合能力上，W34A最强，D17E居中，F30A最弱。以质粒pSU108为模板，通过重叠延伸诱变PCR扩增突变体的cDNA片段。突变体cDNA和载体pSU108分别用SphⅠ、NotⅠ酶双切，然后用T4 DNA连接酶连接定向克隆目的基因。重组质粒转化大肠杆菌DH5a，阳性菌落经小提质粒的酶切鉴定正确后，进行基因测序。测序结果与实验设计相符。
2.测序正确的菌种以及表达STxB的菌种经扩大培养后，在42℃条件下诱导重组蛋白和野生型蛋白的表达。用渗透休克法提取周质蛋白，SDS—PAGE电泳显示有阳性蛋白条带出现。将周质提取物先通过Q—Sepharose FF离子交换柱初步纯化，再用MonoQ HR5/5强阴离子交换剂进一步纯化。SDS—PAGE电泳鉴定目的蛋白的纯度>95％，Western Blot检测纯蛋白为预期的目的蛋白。最后用考马斯亮蓝法定量目的蛋白。
3.以HeLa细胞为研究体系，免疫荧光检测并比较了STxB、W34A、D17E、F30A的转运情况。结果显示，经18℃培养2h，这四种蛋白都能聚集于早期胞内体/循环胞内体。经37℃培养3h，这四种蛋白都能靶向高尔基体。但是部分STxB已呈现内质网定位特征，暗示着与受体结合能力的减弱影响了从早期胞内体/循环胞内体到高尔基体的运输速度。经37℃培养4h，STxB呈现典型的内质网定位特征，而突变配体还定位于高尔基体，且似乎F30A最慢。经37℃培养16 h，STxB的内质网定位特征非常典型，而突变体配体仍旧定位于高尔基体。进一步的研究表明突变体无法到达内质网，在到达高尔基体后降解。表明与受体的结合强弱影响了到内质网的运输，即STxB的胞内运输依赖于STxB—Gb3复合物的稳定作用。
第二部分：比较了STxB和Gb3抗体38-13在HeLa细胞内的胞吞途径。STxB是自然界存在的Gb3配体，而Gb3抗体38-13可以看成是人工合成的配体，两种配体都结合Gb3的寡糖部分。根据结果，Gb3抗体38-13能结合于细胞膜表面，但无法进入细胞内，与STxB的逆向运输路径是完全不一致的。说明STxB在细胞内的运输路径是STxB诱导产生的，而并非利用了细胞内固有的Gb3转运途径。