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目的:探究在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)中饰胶蛋白聚糖(Decorin,DCN)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、致癌基因C-Myc和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin dependent kinase inhibitor,CDKI,P21)四种因子与OSCC发生发展的相关性,以及DCN影响OSCC发生发展的可能机制。
方法:1.选取符合标准的新鲜OSCC组织或石蜡标本共72例,以及正常口腔黏膜组织16例,用于人体组织实验:苏木精-伊红染色实验(hematoxylin and eosin,HE)和免疫组织化学实验(immunohistochemistry IHC);购买HSC-3癌细胞株用于细胞实验:质粒脂质体转染实验、实时荧光定量PCR实验(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)和Western blot实验;2.HE实验观察OSCC组织和正常口腔黏膜组织的病理表现,进行病理分级,根据病理分级情况对所收集的组织进行分组;3.IHC实验检测OSCC组织和正常口腔黏膜组织中DCN、EGFR、C-Myc和P21蛋白的表达情况;4.委托美国GeneCopoeia公司构建DCN质粒和相应的空载体;5.细胞实验分为转染组、空载体组和对照组三组。通过质粒脂质体转染法将DCN质粒(转染组)和空载体(空载体组)分别转入HSC-3细胞,将未进行转染的HSC-3细胞作为对照组,观察转染情况,并计算转染率;6.qRT-PCR实验检测DCN过表达时,HSC-3细胞中EGFR、C-Myc和P21mRNA的相对表达情况;7.Western blot实验检测DCN过表达时,HSC-3细胞中EGFR、C-Myc和P21蛋白的相对表达情况。
结果:1.HE染色结果显示,共收集到16例正常口腔黏膜组织,24例高分化OSCC组织,24例中分化OSCC组织和24例低分化OSCC组织。依据病变严重程度分别记为正常口腔黏膜组(正常组)、OSCC高分化组、OSCC中分化组和OSCC低分化组,共计四组样本;2.IHC结果可见,DCN蛋白主要表达于正常口腔黏膜细胞和OSCC细胞的细胞质和细胞外基质;EGFR蛋白主要表达于正常口腔黏膜的棘层和颗粒层细胞的细胞膜和细胞质,以及OSCC细胞的细胞膜和细胞质;C-Myc蛋白主要表达于OSCC细胞的细胞质和细胞核;P21蛋白主要表达于正常口腔黏膜上皮细胞的细胞质和细胞核,以及OSCC细胞的细胞质。在正常口腔黏膜中,DCN蛋白和P21蛋白呈强阳性表达,EGFR蛋白和C-Myc蛋白呈弱阳性表达。随着OSCC分化程度的降低,DCN蛋白和P21蛋白的着色强度逐渐变浅,阳性表达率逐渐降低;EGFR蛋白和C-Myc蛋白的着色强度逐渐加深,阳性表达率逐渐增加;3.将DCN质粒EX-D0091-M98和空载体EX-NEG-M98转染至HSC-3细胞,48h后在荧光倒置显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,DCN质粒的转染率为98.22%;4.qRT-PCR实验结果显示,转染组、空载体组和对照组细胞中均有EGFR、C-Myc和P21三种基因的表达。DCN质粒转染后,EGFR mRNA的相对表达量降低,约为对照组的0.678倍,差异皆有统计学意义(P<0.05),在空载体组中,EGFRmRNA的相对表达量约为对照组的0.94倍,差异无统计学意义(P>0.05);DCN质粒转染后,C-Myc mRNA的相对表达量降低,约为对照组的0.506倍,其差异有统计学意义(P<0.05),在空载体组中,C-Myc mRNA的相对表达量约为对照组的0.998倍,但差异无统计学意义(P>0.05);DCN质粒转染后,P21mRNA的相对表达量升高,约为对照组的1.678倍,其差异有统计学意义(P<0.05),在空载体组中,P21mRNA的相对表达量约为对照组的1倍,差异无统计学意义(P>0.05);5.Western blot实验结果显示,EGFR、C-Myc、P21三种蛋白在转染组、空载体组和对照组中均有表达。在转染组中,EGFR蛋白的相对表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),在空载体组和对照组间进行比较,EGFR蛋白的相对表达量的差异无统计学意义(P>0.05);在转染组中,C-Myc蛋白的相对表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),在空载体组和对照组间进行比较,C-Myc蛋白的相对表达量的差异无统计学意义(P>0.05);在转染组中,P21蛋白的相对表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),在空载体组和对照组间进行比较,P21蛋白的相对表达量的差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot实验结果与qRT-PCR实验结果相似,在DCN质粒转染前和转染后,HSC-3细胞中均有EGFR、C-Myc和P21的基因和蛋白的表达,且在DCN质粒转染后,EGFR和C-Myc在基因和蛋白水平的相对表达量降低,而P21在基因和蛋白水平的相对表达量升高。
结论:DCN与OSCC的发生、发展过程紧密相关,其对OSCC的作用可能通过调节EGFR、C-Myc和P21而实现。
方法:1.选取符合标准的新鲜OSCC组织或石蜡标本共72例,以及正常口腔黏膜组织16例,用于人体组织实验:苏木精-伊红染色实验(hematoxylin and eosin,HE)和免疫组织化学实验(immunohistochemistry IHC);购买HSC-3癌细胞株用于细胞实验:质粒脂质体转染实验、实时荧光定量PCR实验(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)和Western blot实验;2.HE实验观察OSCC组织和正常口腔黏膜组织的病理表现,进行病理分级,根据病理分级情况对所收集的组织进行分组;3.IHC实验检测OSCC组织和正常口腔黏膜组织中DCN、EGFR、C-Myc和P21蛋白的表达情况;4.委托美国GeneCopoeia公司构建DCN质粒和相应的空载体;5.细胞实验分为转染组、空载体组和对照组三组。通过质粒脂质体转染法将DCN质粒(转染组)和空载体(空载体组)分别转入HSC-3细胞,将未进行转染的HSC-3细胞作为对照组,观察转染情况,并计算转染率;6.qRT-PCR实验检测DCN过表达时,HSC-3细胞中EGFR、C-Myc和P21mRNA的相对表达情况;7.Western blot实验检测DCN过表达时,HSC-3细胞中EGFR、C-Myc和P21蛋白的相对表达情况。
结果:1.HE染色结果显示,共收集到16例正常口腔黏膜组织,24例高分化OSCC组织,24例中分化OSCC组织和24例低分化OSCC组织。依据病变严重程度分别记为正常口腔黏膜组(正常组)、OSCC高分化组、OSCC中分化组和OSCC低分化组,共计四组样本;2.IHC结果可见,DCN蛋白主要表达于正常口腔黏膜细胞和OSCC细胞的细胞质和细胞外基质;EGFR蛋白主要表达于正常口腔黏膜的棘层和颗粒层细胞的细胞膜和细胞质,以及OSCC细胞的细胞膜和细胞质;C-Myc蛋白主要表达于OSCC细胞的细胞质和细胞核;P21蛋白主要表达于正常口腔黏膜上皮细胞的细胞质和细胞核,以及OSCC细胞的细胞质。在正常口腔黏膜中,DCN蛋白和P21蛋白呈强阳性表达,EGFR蛋白和C-Myc蛋白呈弱阳性表达。随着OSCC分化程度的降低,DCN蛋白和P21蛋白的着色强度逐渐变浅,阳性表达率逐渐降低;EGFR蛋白和C-Myc蛋白的着色强度逐渐加深,阳性表达率逐渐增加;3.将DCN质粒EX-D0091-M98和空载体EX-NEG-M98转染至HSC-3细胞,48h后在荧光倒置显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,DCN质粒的转染率为98.22%;4.qRT-PCR实验结果显示,转染组、空载体组和对照组细胞中均有EGFR、C-Myc和P21三种基因的表达。DCN质粒转染后,EGFR mRNA的相对表达量降低,约为对照组的0.678倍,差异皆有统计学意义(P<0.05),在空载体组中,EGFRmRNA的相对表达量约为对照组的0.94倍,差异无统计学意义(P>0.05);DCN质粒转染后,C-Myc mRNA的相对表达量降低,约为对照组的0.506倍,其差异有统计学意义(P<0.05),在空载体组中,C-Myc mRNA的相对表达量约为对照组的0.998倍,但差异无统计学意义(P>0.05);DCN质粒转染后,P21mRNA的相对表达量升高,约为对照组的1.678倍,其差异有统计学意义(P<0.05),在空载体组中,P21mRNA的相对表达量约为对照组的1倍,差异无统计学意义(P>0.05);5.Western blot实验结果显示,EGFR、C-Myc、P21三种蛋白在转染组、空载体组和对照组中均有表达。在转染组中,EGFR蛋白的相对表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),在空载体组和对照组间进行比较,EGFR蛋白的相对表达量的差异无统计学意义(P>0.05);在转染组中,C-Myc蛋白的相对表达水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),在空载体组和对照组间进行比较,C-Myc蛋白的相对表达量的差异无统计学意义(P>0.05);在转染组中,P21蛋白的相对表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),在空载体组和对照组间进行比较,P21蛋白的相对表达量的差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot实验结果与qRT-PCR实验结果相似,在DCN质粒转染前和转染后,HSC-3细胞中均有EGFR、C-Myc和P21的基因和蛋白的表达,且在DCN质粒转染后,EGFR和C-Myc在基因和蛋白水平的相对表达量降低,而P21在基因和蛋白水平的相对表达量升高。
结论:DCN与OSCC的发生、发展过程紧密相关,其对OSCC的作用可能通过调节EGFR、C-Myc和P21而实现。