目的:采用基于质谱的定量乙酰化蛋白质组学技术,筛选糖尿病认知功能障碍大鼠海马组织中差异乙酰化蛋白,分析其主要功能和涉及的信号通路,并初步探索组蛋白乙酰化修饰在糖尿病脑病中发挥的作用,以其为研究糖尿病脑病发病机制提供一个很好的资源和思路。方法:1.Morris水迷宫筛选出认知功能正常SD大鼠30只,随机分为对照组和糖尿病组(n=15),糖尿病组采用一次性腹腔注射链脲佐菌素复制糖尿病大鼠模型,每周监测各组大鼠血糖状况。2.糖尿病模型复制12周后,Morris水迷宫检测大鼠认知功能变化。3.HE染色观察大鼠海马组织的病理学变化。4.随机选取对照组中认知功能正常和糖尿病组中认知功能障碍的大鼠各3只,利用基于质谱技术的定量乙酰化蛋白质组学方法对上述大鼠海马组织中的差异乙酰化蛋白进行精确的鉴定及定量分析,结合生物信息学方法进行GO分析、亚细胞定位分析、COG功能分类、KEGG通路富集分析等。5.Western blot检测部分差异性组蛋白乙酰化修饰位点H4K8ac、H4K12ac和H4K16ac表达情况。6.体外培养小鼠海马神经元HT-22细胞,使用不同含糖量培养基(25、35、45、55、65、75mmol/L)分别作用细胞24h、48h、72h,以25mmol/L基准糖浓度作为对照组,其余为实验组,采用CCK-8法检测各组细胞活力,并确定最适高糖作用时间。7.光学显微镜观察各组细胞形态变化。8.乳酸脱氢酶(LDH)实验检测细胞上清液中LDH释放率。9.流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。10.Western blot检测凋亡蛋白Bcl-2、Bax表达情况,并确定最适高糖作用浓度。11.在最适高糖作用时间和作用浓度的条件下,Western blot检测组蛋白乙酰化修饰位点H4K8ac、H4K12ac和H4K16ac表达情况。结果:1.成功筛选认知功能正常的SD大鼠30只,成功复制糖尿病大鼠模型,与对照组相比,糖尿病组大鼠空腹血糖水平显著升高,基本维持在20mmol/L以上(P<0.01)。2.与对照组相比,糖尿病组大鼠的逃避潜伏期显著增加,穿越平台次数显著下降(P<0.01),学习和记忆能力受损伤。3.HE染色结果显示与对照组相比,糖尿病组大鼠海马组织结构紊乱,细胞排列疏松且不规则,胞核淡染,细胞皱缩,数量减少。4.质谱分析共鉴定到61个蛋白上的66个乙酰化修饰位点水平有显著改变,以1.5倍为变化阈值,其中43个蛋白上的44个乙酰化修饰位点水平显著上调,18个蛋白上22个乙酰化修饰位点水平显著下调(P<0.05),又发现在糖尿病组中,组蛋白H4K8、H4K12和H4K16位点的定量乙酰化水平显著低于对照组(P<0.05)。生物信息学GO分析发现这些差异乙酰化蛋白主要为具有结合功能和催化功能的蛋白,主要参与细胞进程、代谢过程和生物调节过程。亚细胞结构定位分析发现,绝大部分蛋白被预测分析定位在细胞核和细胞质上。COG功能分类显示,主要生物学功能集中在信号转导机制,翻译后修饰、蛋白折叠、分子伴侣,能量产生和转换,染色质结构动力学,氨基酸转运和代谢等方面。KEGG通路富集分析发现主要参与代谢和内分泌相关通路,如半胱氨酸和蛋氨酸代谢,烟酸和烟酰胺代谢,甲状腺激素合成以及c GMP-PKG信号通路等。5.Western blot结果显示,糖尿病组海马组织中H4K8ac、H4K12ac和H4K16ac表达降低(P<0.01)。6.CCK-8结果显示与对照组相比,不同浓度的葡萄糖可抑制细胞活力,具有剂量和时间依赖性(P<0.05),当作用48h时大部分细胞活力在80%左右,可满足后续实验要求,因此,确定48h为最适高糖作用时间。7.光学显微镜观察细胞形态变化,与对照组相比,其他各实验组出现细胞数目减少,胞体变大,部分胞核溶解,突触断裂,细胞碎片等现象。8.与对照组相比,其他各实验组LDH释放率显著上升,以55、65、75mmol/L高糖组最为显著(P<0.05)。9.流式细胞术检测发现,与对照组相比,其他各实验组细胞的凋亡率显著增加(P<0.05)。10.Western blot结果发现与对照组相比,55、65、75mmol/L高糖组中的Bax表达升高,Bcl-2表达下降(P<0.05),综合上述细胞实验确定55mmol/L为最佳高糖作用浓度。11.Western blot结果发现,高糖组中H4K8ac、H4K12ac和H4K16ac表达降低(P<0.01)。结论:1.与认知功能正常大鼠相比,糖尿病认知功能障碍大鼠海马组织中多种蛋白出现显著乙酰化修饰改变,组蛋白乙酰化修饰可能与糖尿病脑病发病机制有一定的关系。2.确定高糖浓度55mmol/L作用小鼠海马神经元HT-22细胞48h为最佳造模条件,在此基础上,组蛋白H4K8、H4K12和H4K16位点乙酰化修饰水平显著降低。