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黄连解毒汤是经典的清热解毒方剂,现代药理学研究表明黄连解毒汤具有抗炎、抗氧化、降血糖以及神经保护等多种药理作用。目的:建立黄连解毒汤(Huang-lian-jie-du decoction,HLJDD)中13种主要活性成分的高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)检测方法;采用系统溶剂提取法制备HLJDD不同极性部位,通过检测不同极性部位中活性成分含量来筛选HLJDD有效部位;在此基础上将HLJDD中含量最高的四种活性成分按原方比例配伍组成“HLJDD活性物质组方”,并通过体内外实验评价HLJDD活性物质组方的安全性。方法:1、采用Agilent 1260型高效液相色谱仪建立HLJDD中13种活性成分的HPLC检测方法并测定HLJDD中各活性成分含量。2、依次采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、纯净水对HLJDD水煎液的冻干粉进行系统溶剂提取,制备HLJDD不同极性部位;使用HPLC法测定HLJDD不同极性部位中各活性成分的含量,根据检测结果筛选HLJDD有效部位。3、将HLJDD中含量最高的四种活性成分按照HPLC检测比例进行配伍组成HLJDD活性物质组方,采用噻唑蓝(MTT)分别检测HLJDD、HLJDD正丁醇部位、京尼平苷、小檗碱、巴马汀、黄芩苷以及HLJDD活性物质组方对Caco-2细胞活力的影响,检测各药物的细胞毒性。4、将清洁级昆明小鼠分为空白组和四个不同浓度活性物质组方给药组,空白组给予蒸馏水,实验组分别给予浓度为5100 mg/kg、1275 mg/kg、318.75 mg/kg、79.6875 mg/kg的HLJDD活性物质组方混悬液,一次性灌胃给药;给药后饲养观察7天,期间观察记录各组小鼠临床表现,致死及饮食情况;7天后处死各组小鼠,观察各脏器损伤并计算脏器指数,确定HLJDD活性物质组方的急性毒性。结果与结论:1、通过精密度、重复性、稳定性以及加样回收等实验证明所建立的HPLC检测方法稳定可靠,并用该方法测得HLJDD中13种活性成分的含量。2、根据HLJDD干粉计算,HLJDD石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水、沉淀部位的得率分别是0.718%、5.15%、64.45%、25.76%、3.70%;HPLC检测结果显示正丁醇部位各活性成分含量和比例均与HLJDD相近,故推测HLJDD正丁醇部位为HLJDD有效部位。HLJDD及HLJDD正丁醇部位中含量最高的四种活性成分均为京尼平苷、小檗碱、巴马汀、黄芩苷,将这四种活性成分按原方比例配伍组成HLJDD活性物质组方(京尼平苷44.21%、小檗碱32.42%、巴马汀12.02%、黄芩苷11.35%)。3、MTT检测结果显示,Caco-2细胞分别经162.5μg/mL HLJDD、100μg/mL HLJDD正丁醇部位、100μg/mL京尼平苷、100μg/mL黄芩苷、50μg/mL巴马汀、6.25μg/mL小檗碱以及12.5μg/mL HLJDD活性物质组方处理后存活率均大于90%,说明干预浓度不大于上述浓度时对Caco-2细胞无毒性,可用于Caco-2细胞试验。4、HLJDD活性成分组方急性毒性实验结果显示,灌胃2 h后5100 mg/kg组雄性小鼠死亡一只,剖检可见肝脏肿大、质地变脆、色泽不均一,而且有弥漫性白色斑点;脾脏和肾脏轻微肿胀,肺脏有淤血、出血。其余小鼠7天内无死亡。给药后最高剂量组表现懒动、少食、抱团,第二天症状好转;其他给药组小鼠无明显异常状况。病理剖检发现5100 mg/kg给药组肝脏肿大、质脆,肝和脾脏器指数与空白组;差异显著(P<0.05);各组心脏脏器指数均增加,但与空白组差异不显著(P>0.05),其他组脏器无明显异常。根据以上评价指标可推测HLJDD活性物质组方在浓度为5100 mg/kg时有肝毒性,1275 mg/kg时无急性毒性。本研究建立了HLJDD中主要成分的检测方法并筛选出其有效部位,考察了其活性物质组方的安全性为HLJDD药理研究奠定了基础。