随着生活节奏日益加快，人们的步伐也在加快，社交活动范围不断扩大，出行越来越依赖交通工具，交通事故频发，创伤类型繁多复杂，其中就有一类是关节的开放性损伤，不仅如此在激烈对抗的运动场上，在忙碌的工地上，在轰鸣的工厂里这样的损伤都不少见。接踵而至的关节软骨损伤，同时又因为开放的外伤，引发进一步的关节感染，令许多专家束手无策。由于关节腔是一个密闭的空腔，关节软骨和滑膜，还有韧带等附属结构是关节腔内的主要成分，内部血运循环薄弱，抗生素通过静脉途径分布到关节腔内部达到的药物浓度对于关节腔内致病菌来说雷声大，雨点小，不仅效价比低，治疗效果差，还增添了全身用药的副作用。抗生素如果局部反复注射不但可能招致外源性感染，还会引起细菌耐药，患者也会畏惧重复性的注射疼痛。无神经支配、血供差及软骨细胞再生能力低下等组织学特点致使软骨组织修复困难重重。感染的致病菌的持续破坏将导致任何修复形式的失败，因此修复软骨缺损的首要前提就是控制感染，本课题拟通过构建BMSCs–庆大霉素-藻酸盐三维缓释支架，移植入感染金黄色葡萄球菌的兔膝关节软骨缺损处，通过测肛温，血常规、血沉、CRP等血液炎性指标的检测，细菌培养，大体观察，H-E染色、masson染色、甲苯胺蓝染色、阿利辛蓝染色、Ⅱ型胶原染色等检测方法，了解三维缓释支架庆大霉素的抗菌能力、感染的控制情况，评估软骨缺损的修复情况，为临床应用的可行性提供参考。目的：构建BMSCs–庆大霉素-藻酸盐三维缓释支架，移植入感染金黄色葡萄球菌的兔膝关节软骨缺损处，检测三维缓释支架的抗菌能力及感染的控制情况，评估软骨缺损的修复情况。方法：1、兔骨髓血贴壁筛选法分离、纯化骨髓间充质干细胞（BMSCs），进行孵箱增殖培养扩增传代，应用H-E染色及CD34、CD44、CD90、CD105抗体等免疫组化染色方法对传代的细胞进行鉴定。2、进行BMSCs-庆大霉素-藻酸盐支架的制作并置于培养皿培养，进行不同时间点的细胞计数、绘制生长曲线来了解细胞的增殖能力，通过支架的H-E染色、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原染色等观察BMSCs向软骨细胞转化的情况，初步判断庆大霉素是否影响BMSCs细胞和软骨细胞的增殖和分化。3、构建非感染兔膝关节软骨缺损模型A及金黄色葡萄球菌感染的兔膝关节软骨缺损模型（B、C、D），分别在已造成软骨缺损的关节中注入金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC25923）1107cfu/ml、1106cfu/ml、1105cfu/ml各0.5ml，获得金黄色葡萄球菌感染的兔膝关节软骨缺损动物模型（B、C、D），通过测肛温，血常规、血沉、CRP等血液炎性指标的检测，细菌培养，评估所建模型是否能达到预期效果，稳定性及可重复性如何。选择合适的剂量的组别作为后续实验的动物模型。4、将藻酸钙组（支架Ⅰ）、BMSCs-藻酸钙组（支架Ⅱ）、BMSCs-庆大霉素-藻酸钙组（支架Ⅲ）、空白对照组（空白）分别种植于非感染兔膝关节软骨缺损模型中，通过测肛温，血液检测，细菌培养，大体观察，H-E染色、masson染色、甲苯胺蓝染色、阿利辛蓝染色、Ⅱ型胶原染色等检测方法，来比较各组软骨修复的情况。5、将藻酸钙组（支架Ⅰ）、BMSCs-藻酸钙组（支架Ⅱ）、BMSCs-庆大霉素-藻酸钙组（支架Ⅲ）、庆大霉素-藻酸钙组（支架Ⅳ）、空白对照组（空白）分别种植于金黄色葡萄球菌感染的兔膝关节软骨缺损模型中，通过通过测肛温，血常规、血沉、CRP等血液炎性指标的检测，细菌培养，大体观察，H-E染色、masson染色、甲苯胺蓝染色、阿利辛蓝染色、Ⅱ型胶原染色等检测方法，来比较各组细菌感染控制情况及软骨修复的情况。结果：1、获取的BMSCs贴壁迅速，细胞大小接近，外形为纺锤形或短梭形；采用流式细胞仪检查发现培养的第2代细胞抗CD44、抗CD90、抗CD105（+），CD34（－）；Ⅱ型胶原免疫组化染色（－）。2、BMSCs在三维缓释支架中具有良好的生物学活性；CCK-8细胞计数测定BMSCs的增殖良好，培养超过两周，支架中的细胞的Ⅱ型胶原染色（+），甲苯胺蓝染色（+），均符合软骨细胞的特点。3、非感染兔膝关节软骨缺损模型A造模成功，金黄色葡萄球菌感染的兔膝关节软骨缺损模型B（ATCC259230.5107cfu），术前及术后测肛温，血常规、血沉、CRP等血液炎性指标的检测，细菌培养，均提示组内所有兔膝关节感染成功，术前的各项指标与A组相比差异无统计学意义（P>0.05），术后的肛温及血液各项指标较A组高，细菌培养均阳性，相比A组，差异有统计学意义（P<0.05）。模型C和D由于细菌感染剂量不足，仅有部分兔膝关节感染。4、非感染兔膝关节软骨缺损模型中支架Ⅰ、支架Ⅱ、支架Ⅲ及空白组种植前与种植后的肛温，血液炎性指标及细菌培养结果，两两间比较差异无统学意义（P>0.05）。H-E染色、masson染色、甲苯胺蓝染色、阿利辛蓝染色、Ⅱ型胶原染色提示：支架Ⅰ组能够修复软骨缺损处，主体为透明软骨，周围环绕纤维软骨，修复的软骨层较薄，细胞排列及层次结构较乱；支架Ⅱ、支架Ⅲ组修复软骨缺损处总体较满意，基本为透明软骨，周围边缘有纤维软骨，修复的软骨层厚度基本能和边界等高，可见中央细胞排列尚可，层次结构较清楚，细胞外环绕产物丰富；空白组软骨缺损处仍明显，表层主要为纤维软骨，修复的软骨层菲薄，细胞排列及层次结构杂乱。5、金黄色葡萄球菌感染的兔膝关节软骨缺损模型中：种植前与种植后的肛温，血液炎性指标及细菌培养结果，两两间比较差异无统学意义（P>0.05）；支架Ⅲ、支架Ⅳ组种植前与种植后的肛温，血液炎性指标及细菌培养结果，两组间差异无统学意义（P>0.05）；支架Ⅰ、支架Ⅱ及空白组与支架Ⅲ或支架Ⅳ组间的差异有统计学意义（P<0.05）。H-E染色、masson染色、甲苯胺蓝染色、阿利辛蓝染色、Ⅱ型胶原染色提示：支架Ⅰ、支架Ⅱ、空白组软骨缺损处依旧明显，甚至缺损范围扩大，周围骨赘增生，关节退变明显，大量炎性细胞充填，层次结构混乱；支架Ⅲ组修复软骨缺损处总体较满意，基本为透明软骨，周围边缘有纤维软骨，修复的软骨层厚度和边界等高，可见中央细胞排列尚可，层次结构较清楚，细胞外环绕产物丰富；；支架Ⅳ组能够修复软骨缺损处，主体为透明软骨，周围环绕纤维软骨，修复的软骨层较薄，细胞排列及层次结构较乱。结论：1、兔BMSCs经贴壁筛选法分离、纯化，流式细胞仪检测CD34（－），CD44、CD90、CD105抗体（+），Ⅱ型胶原抗体免疫组化染色（－），符合BMSCs的特点，证明按此方法分离培养可获取未分化的高纯度的BMSCs。2、BMSCs在庆大霉素-藻酸钙三维支架中持续缓释庆大霉素的情况下保持其生物学活性，呈立体生长且增殖良好，培养1周-3周时细胞增殖活跃，Ⅱ型胶原抗体免疫组化染色及甲苯胺蓝染色均提示BMSCs最终分化成为软骨细胞。3、非感染兔膝关节软骨缺损模型A造模结果理想，可做为后期种植支架的动物模型；金黄色葡萄球菌感染的兔膝关节软骨缺损模型B造模结果理想，细菌感染率达100%，可做为后期种植支架的动物模型；模型C和D由于细菌感染剂量不足，细菌感染率分别为66.7%和33.3%，不能达到预设的动物模型标准，不能做为后期试验的动物模型。4、非感染兔膝关节软骨缺损模型中支架Ⅰ、支架Ⅱ、支架Ⅲ及空白组种植前与种植后的炎症指标变化没有差别。通过对多种染色的综合分析得出：支架Ⅱ、支架Ⅲ组修复软骨缺损最为理想，基本接近透明软骨，与缺损区域周围平齐；而支架Ⅰ组软骨修复能力稍差，大部分修复成为透明软骨，缺损区域与支架间为纤维软骨修复，部分区域存在高低不平现象；空白组软骨缺损区修复成为纤维软骨，且修复不平整。5、金黄色葡萄球菌感染的兔膝关节软骨缺损模型中：支架Ⅲ、支架Ⅳ组种植后肛温，血液炎性指标迅速下降，关节冲洗液细菌培养结果转阴，提示关节细菌感染控制理想，细菌被杀灭；支架Ⅰ、支架Ⅱ及空白组种植后肛温、各类炎性指标及关节冲洗液细菌培养均无明显变化，提示关节细菌感染没有得到有效控制，炎症反应持续。通过对多种染色的综合分析得出：支架Ⅲ组修复软骨缺损最为理想，基本接近透明软骨，与缺损区域周围平齐，炎症细胞少；而支架Ⅳ组软骨修复能力稍差，大部分修复成为透明软骨，缺损区域与支架间为纤维软骨修复，部分区域存在高低不平现象，炎症细胞少；支架Ⅰ、支架Ⅱ、空白组因感染控制不力，缺损区域软骨破坏明显，炎症细胞浸润，修复失败。