【摘 要】
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玉米（Zea mays L.）淀粉是人体生存所必需的能量和营养来源,尤其是高直链玉米淀粉是多个领域的重要原材料。此外,抗性淀粉（Resistant Starch,RS）一般来源于高直链淀粉,RS可以降低肠道疾病的发生率及降低血糖和胰岛素反应,有益维护健康。在普通玉米中,通常只含有25%的直链淀粉甚至更少,所以其抗性淀粉含量也较低,通常不到1%,所以通过增加玉米中的直链淀粉含量来增加抗性淀粉含量就成
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玉米（Zea mays L.）淀粉是人体生存所必需的能量和营养来源,尤其是高直链玉米淀粉是多个领域的重要原材料。此外,抗性淀粉（Resistant Starch,RS）一般来源于高直链淀粉,RS可以降低肠道疾病的发生率及降低血糖和胰岛素反应,有益维护健康。在普通玉米中,通常只含有25%的直链淀粉甚至更少,所以其抗性淀粉含量也较低,通常不到1%,所以通过增加玉米中的直链淀粉含量来增加抗性淀粉含量就成为了重要的育种手段之一。以往通过RNAi或诱变研究发现,淀粉分支酶SBE尤其是SBEⅡb对淀粉的精细结构和性质具有显著的影响,其酶活丧失后淀粉含有极高的直链淀粉和RS,而SBE1酶活丧失虽对淀粉组成与特性影响不大,但淀粉的消化率略有降低。目前以转基因为代表的现代生物技术,特别是CRISPR/Cas9基因编辑技术已被广泛用于作物育种改良,为作物育种提供了全新可行的技术。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对淀粉合成途径中与支链淀粉合成相关的ZmSBEⅠ和ZmSBEⅡb两个基因进行进行定点基因编辑,获得新型高直链淀粉玉米种质,主要研究结果如下:（1）根据目标基因ZmSBEⅠ、ZmSBEⅡb序列分析,设计合适sgRNA并进行扩增验证,构建CRISPR/Cas9载体,通过测序分析表明构建成功并进行转化。（2）对T0、T1代基因编辑位置进行PCR扩增和测序分析,筛选出sbe1、sbe2b的单基因突变及sbe1sbe2b双基因突变,确定其突变类型。利用Bar基因检测选择不含有转基因的株系进行扩繁,并用于下一步分析。（3）对野生型及三种突变体进行农艺性状的比较发现,三种突变体的百粒重均显著降低,野生型为32.67g,其中sbe1sbe2b降幅最大达14g。（4）通过对不同突变体进行扫描电镜观察表明,sbe1突变体的淀粉颗粒形状变化不大,而sbe2b及sbe1sbe2b突变体中出现不规则、长条形淀粉颗粒,大颗粒减少。通过粒径分析发现,三种突变体的淀粉粒径均降低,其中sbe2b与sbe1sbe2b降低最显著分别减少了2.5μm和2μm,与扫描电镜观察结果一致。（5）sbe1突变体的直链淀粉含量（AC）为30.95%,与野生型相比无明显变化。而其他两个突变体AC显著增加,其中sbe2b突变体AC达53.43%,sbe1sbe2b突变体AC略低为48.21%。此外,sbe1sbe2b突变体的抗性淀粉含量较sbe2b高出7%达到了34.04%。对不同突变体进行链长分布分析发现sbe2b和sbe1sbe2b突变体的短链（DP＜20）减少而中长链、长链（DP＞60）增加,且sbe1、sbe1sbe2b突变体的糊化温度温度有所增加,但糊化焓降低。综上所述,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术同时靶向玉米淀粉合成关键酶ZmSBE1和ZmSBEⅡb可以创制出含有高直链淀粉和抗性淀粉的玉米新种质。
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