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[背景与目的]肺癌是癌症死亡的首要原因,占全世界癌症死亡人数的18%,已成为对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤。其原因除了肺癌的生物学特性复杂、恶性程度高以外,更重要的是,肺癌患者确诊时大多已发生了局部或广泛转移。与其他类型肺癌相比,肺腺癌在肺癌中的构成比逐年增多,且更容易发生转移,带有转移灶的晚期肺腺癌患者,经治疗后的5年生存率不足10%。淋巴转移是造成肺癌预后不良及死亡的主要原因之一。因此,有效防治肺腺癌淋巴转移是临床亟待解决的难题之一。我们前期课题在研究TGF-β 1与肺腺癌淋巴转移的过程中,选取了多株肺腺癌细胞系,经TGF-β 1处理后观察,部分细胞株发生了上皮细胞向间质细胞转化的形态学改变,而另一部分细胞则仍保留了上皮样细胞的形态。由此猜想,对TGF-β 1处理反应不同的两类肺腺癌细胞是否可能与EGFR突变型肺腺癌和EGFR野生型肺腺癌一样是生物学行为不同的两类肺腺癌。若猜想成立,其治疗方式和预后也可能不一样。因此,我们根据TGF-β 1处理后肺腺癌细胞是否发生形态学改变将其分为TGF-β 1敏感组和不敏感组。分析两组细胞株中EMT标记物、干细胞标记物0CT4、S0X2、Nanog的表达情况及侵袭增殖能力等生物学行为。如有价值进一步研究VEGF-C、VEGFR3的表达情况及TGF-β 1影响上述分子表达的机制。进一步探索TGF-β 1将肺腺癌分为敏感和非敏感型的价值,为肺腺癌淋巴转移患者的防治工作提供新的研究思路。[方法]选取多株不同的肺腺癌细胞系(NCI-H1993,A549,NCI-H358,NCI-H1975,NCI-H1650,HCC827),经2.5ng/ml TGF-β 1处理2周后观察其形态学变化,根据处理后是否发生EMT形态学改变将上述细胞株分为TGF-β 1敏感组和不敏感组。细胞侵袭实验和克隆形成实验分析两组细胞株增殖侵袭能力是否有差异;PCR和western blot检测两组细胞株中EMT标志物波形蛋白和钙粘蛋白、干细胞标记物S0X2、OCT4、Nanog以及VEGFR3的表达差异;检测VEGF-C在两组细胞中ERK信号通路激活情况;TGF β RI激酶抑制剂和siRNA抑制TGF-β 1表达研究该通路参与两组细胞株中VEGF-C上调表达的机制是否相同。[结果]1.TGF β 1诱导某些肺腺癌细胞株发生EMT。A549和NCI-H1993细胞经2.5 ng/ml TGFβ 1处理2周后发生上皮-间质样细胞改变。NCI-H1650和HCC827细胞经TGFβ1处理后未发生相应的形态改变。RT-PCR显示经2.5 ng/ml TGFβ 1处理2周后,A549和NCI-H1993细胞中,钙黏蛋白mRNA表达显著下降(与NCI-H1975对比,**P<0.01,***P<0.001),但NCI-H358,NCI-H1975,NCI-H1650 和 HCC827 细胞中则无此现象。同时,A549,NCI-H358 和 NCI-H1993 中波形蛋白 mRNA 表达上调,NCI-H1975,NCI-H1650 和 HCC827 细胞中则无。Western blotting 证实 TGF β 1可以促进敏感型NSCLC细胞中波形蛋白的表达,降低钙黏蛋白的表达。2.TGFβ 1降低TGF β 1敏感型肺腺癌细胞中的细胞活性,增强其侵袭力及克隆形成能力。2.5 ng/ml TGF β 1处理两周后,A549、NCI-H358 和 NCI-H1993的细胞活性显著降低,但NCI-H1975、NCI-H1650和HCC827细胞的生长情况不受影响(与未处理组比较,***P<0 001)。细胞侵袭实验显示,2.5 ng/ml TGFβ l处理两周后,A549、NCI-H358和NCI-H1993细胞转移情况明显增强,NCI-H1975、NCI-H1650和HCC827则未表现出相似特性。2.5 ng/ml TGF β 1处理两周后,A549,NCI-H358 和 NCI-H1993 克隆形成能力明显增强,NCI-H1975,NCI-H1650和HCC827则无(*P<0 05,**P<0.01)。3.TGFβ 1能够增强敏感型肺腺癌细胞系中肺癌干细胞标志物的表达。2.5 ng/ml TGFβ 1处理两周后,RT-PCT结果提示与未处理组相比,A549,NCI-H358 和 NCI-H1993 中 Oct4 和 Sox2 mmRNA 表达上升(**P<0 01,***P<0.001)。而 NCI-1650、HCC827 中 Oct4,Nanog 和 Sox2 表达情况无变化。4.TGFβ 1通路参与了敏感型肺腺癌细胞系内VEGF-C表达的调节。RT-PCR提示,A549、NCI-H358和NCI-H1993中VEGFR3 mRNA表达水平明显高于NCI-H1975、NCI-H1650 和 HCC827(与对照组 NCI-H1975,***P<0.001)。Western blot结果提示,10 ng/ml人重组VEGF-C处理30-60分钟后NCI-H1993细胞内ERK通路被激活,而NCI-H1975则无。经2.5 ng/ml TGF β 1处理后,RT-PCR结果提示NCI-H1993细胞内VEGF-C mRNA表达明显升高。加入0.1 μM LY2157299能够明显抑制TGF β 1诱导的VEGF-C表达。siRNA靶向TGFβ R1能够显著降低TGFβ R1诱导的VEGF-C表达(***P<0.001)。[结论]1.TGF β 1可诱导部分肺腺癌细胞株发生EMT,促进该类细胞株中干细胞特性的表达及增殖侵袭能力;2.不同肺腺癌细胞对TGFβ 1敏感性不同,可能与细胞株来源于不同分期的肺癌患者、细胞变异等有关,由此引入敏感性概念;3.TGF β 1敏感型细胞株中VEGF-C、VEGFR3的表达情况与其干细胞特性的表达及细胞功能实验结果一致,提示TGF β 1通路可能参与了敏感型肺腺癌细胞系内VEGF-C表达的调节;4.本实验中探讨了 TGFβ 1影响敏感型肺腺癌细胞株中干性、功能及肿瘤淋巴转移的标志分子VEGF-C的相关性,可为其作为肺癌新分型、探索抑制淋巴转移的靶点提供思路。