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类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一类自身免疫性疾病,主要以慢性滑膜炎症、软骨和骨质破坏为主要特征,是造成人群致残和丧失劳动力的主要病因之一。目前RA的发病机制尚未完全阐明,研究证明滑膜组织过度增生和关节软骨损伤与RA不可逆残障具有直接关系,积极探索RA滑膜过度增生和软骨损伤的可能机制及其创新药物具有重要意义。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是与水通透性相关的膜转运蛋白,目前在哺乳动物中已克隆和鉴定出13种AQPs(AQP0-12),AQPs结构中存在对pH值敏感的区域和渗透压反应元件,在RA发病过程中,滑膜炎导致关节局部组织酸化、关节腔内滑液PH值下降,软骨基质大量降解进入关节腔引起渗透压改变,上述因素均可能导致滑膜组织中AQPs活化。既往文献表明RA滑膜组织中AQP1存在异常高表达,与RA滑膜炎症、关节积水和软骨/骨损伤等密切相关,干预AQP1可能是遏制RA滑膜炎和关节损伤的关键环节和有效措施。乙酰唑胺(Acetazolamide,AZ)作为一种碳酸苷酶抑制剂可以抑制AQP1介导的水渗透性,还能直接抑制AQP1蛋白表达,具有抑制肿瘤转移和血管生成的能力。在本研究中,我们使用AZ作为合适的AQP1抑制剂,观察AZ对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用并探讨其可能机制,为RA的防治提供新靶点和新思路。本研究主要分为以下两个方面的内容:1.乙酰唑胺对佐剂性关节大鼠的治疗作用及相关机制研究目的:研究乙酰唑胺(AZ)对大鼠佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis,AIA)的影响及其相关机制。方法:完全弗氏佐剂对大鼠左后足皮下注射制备AIA模型,不同剂量AZ灌胃给药。足肿胀仪检测继发侧足肿胀度并进行关节炎指数评分,ELISA法检测血清TNF-α和IL-β的水平,HE染色观察踝关节病理组织学变化,阿利新蓝染色法检测软骨中蛋白多糖的表达。实时荧光定量PCR法检测软骨组织中Ⅱ型胶原(COⅡ)和聚集蛋白多糖(Aggrecan)的mRNA水平。Western-blot法检测滑膜组织中AQP1、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65和p-NF-κB p65的蛋白表达。结果:AZ能抑制AIA大鼠后足肿胀和关节炎指数,降低血清TNF-α,IL-β的水平,改善踝关节病理组织学指标。AZ能增加软骨组织中蛋白聚糖的产生及Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA的表达。AZ能降低滑膜组织中AQP1的蛋白表达,此外,AZ抑制IκBα的降解和磷酸化,降低p-NF-κB p65的蛋白表达,进而抑制NF-κB通路的激活。2.乙酰唑胺对IL-1β诱导的大鼠关节软骨细胞凋亡的影响及机制研究目的:探讨AQP1抑制剂乙酰唑胺(AZ)对IL-1β诱导的大鼠关节软骨细胞凋亡的影响及机制。方法分离培养大鼠关节软骨细胞主要采用胰酶-胶原酶法,IL-1β诱导软骨细胞凋亡,AZ体外处理IL-1β刺激的关节软骨细胞,MTT法检测细胞增殖,hoechst 33342染色、Annexin V-FITC/PI双染和rhodamine-123染色检测细胞凋亡,Westernblot检测AQP1,Bcl-2,Bax,Caspase3,IκBα,p-IκBα,NF-κB p65和p-NF-κB p65的蛋白表达。结果AZ(12.5、25、50μmol/L)剂量依赖性地提高IL-1β诱导的软骨细胞增殖;AZ可以抑制IL-1β诱导的大鼠关节软骨细胞凋亡,表现为减少细胞凋亡形态学改变、降低软骨细胞凋亡率和提高软骨细胞线粒体膜电位;与正常组比较,IL-1β组AQP1蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达降低,Bax和Caspase3蛋白表达升高,IκB蛋白表达下降,p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表达增加;与IL-1β组比较,AZ抑制AQP1表达,提高Bcl-2表达,降低Bax和Caspase3表达,抑制IκBα的降解和磷酸化,并减少p-NF-κB p65蛋白表达。结论AZ体外能抑制IL-1β诱导的关节软骨细胞凋亡,项结果可能与下调Caspase3和Bax(均为促凋亡基因)表达、上调Bcl-2(抗凋亡基因)表达及抑制NF-κB炎症通路活化有关。