大环内酯类抗生素通常是以14～16元内酯环为母核,在母核的不同位置连接着甲基、乙基、羟基、羰基和糖基等各种取代基,是一种性质比较稳定的弱碱性物质。大环内酯类抗生素不但对各种敏感菌和耐药菌表现出优异的体内和体外抗菌作用,而且还具有良好的药代动力学性质,如生物利用度高、血药浓度高、达峰时间短、半衰期长等。因此大环内酯类抗生素是目前临床上最常用的抗生素之一,它们主要用于治疗金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌等革兰阳性菌引起的各种感染。大环内酯类抗生素的结合位点位于细菌核糖体的23S rRNA中,可以和此处的G2057、A2058、A2059、G2505、A2062和U790等碱基发生结合并堵塞新生肽释放通道,同时促进短酰基肽tRNA与核糖体的解离,使肽链的延长过程终止,从而抑制细菌蛋白质合成,最终使大环内酯类抗生素表现出抗菌活性。大环内酯类抗生素的耐药性通常是由结合位点修饰或突变、主动外排和酶灭活产生的,23S rRNA甲基化修饰、核糖体RNA突变、核糖体蛋白质变异、细菌外排泵的主动外排和基于酶机制的耐药是大环内酯类抗生素最常见的几种耐药机制。自从第一个大环内酯类抗生素苦霉素于1950年发现以来,大环内酯类抗生素的发展已经历经了四代。第一代到第四代大环内酯类抗生素的发展历程表明:(1)从最初的体内酸不稳定性,副作用大(如红霉素)发展到具有优良的药代动力学性质,如体内稳定性好、生物利用度高、组织浓度高和半衰期长等(如克拉霉素和阿奇霉素);(2)从最初的抗菌谱窄,抗耐药菌活性差(如红霉素、克拉霉素和阿奇霉素等)发展到对各种呼吸道病原体的抗菌活性越来越强,尤其对于erm基因介导的MLSB型和mef基因介导的M型耐药菌表现出强烈的抗菌作用(如泰利霉素、喹红霉素和索利霉素)。以上取得的巨大进步和成功为有效缓解细菌耐药性问题带来了希望。大环内酯类抗生素的研发历程表明得到新型大环内酯母核和引入芳烷基侧链的结构改造是研发出新型抗菌药的主要途径和方法。我们基于“片段切割和结合”的设计策略,首先将克拉霉素的14元内酯环通过氧化反应开环,接着引入适当的芳烷基侧链,最后经酯化反应重新构建新型15元内酯环。我们得到的新型15元内酯环母核,其立体构象会发生一定程度的变化以有利于与细菌核糖体的结合。各种芳烷基侧链也可以灵活的引入到内酯环上,它们可以与细菌核糖体23S rRNA结构域Ⅱ发生结合。因此,我们设计、合成了 5个系列共计103个N-11,C-12,C-13和C-9位芳烷基克拉霉素半合成衍生物,并对它们的抗菌活性、杀菌活性、杀菌动力学和细胞毒性进行了测定和评价。我们使用肉汤微量稀释法测定A、B、C、D和E系列化合物的最低抑菌浓度(MIC),以克拉霉素和阿奇霉素作为对照,对它们的抗菌活性进行评价,结果如下所示:1.抗敏感菌活性:对于敏感型S.aureus3,ATCC2592C和D系列化合物表现出优异的抗菌活性,其中化合物49b、491和49v(属于D系列)表现出最强的抗菌活性(MIC≤0.25μg/mL),与克拉霉素相当(MIC≤0.25μg/mL);对于B.subtilis ATCC9372,A、C和D系列化合物表现出极强的抗菌活性,其中C系列化合物中的36g、36h和36j(MIC ≤ 0.25 μg/mL)和D系列化合物中的49b、49d、49f、491和49v(MIC≤0.25μg/mL)表现出最强的抗菌活性,与克拉霉素(MIC≤0.25 μg/mL)相当;对于E.coli ATCC25922和P.aeruginosa ATCC27853,所有的目标化合物和克拉霉素均表现出较弱的抗菌活性。综上所述,化合物49b、491和49v在所有的目标化合物中表现出最强的抗菌作用,对于敏感型S.aureus ATCC25923 和 B.subtilis ATCC9372表现出优异的抗菌活性(MIC≤0.25 μg/mL)。此外,对于E.coli ATCC25922和P.aeruginosa ATCC27853,这三个化合物的抗菌活性与克拉霉素相比也表现出一定的提高。2.抗耐药菌活性:A、B、C和D系列化合物中均有多个化合物对耐药菌表现出强烈的抗菌作用。对于耐药型P.aureus ATCC3 1007,A系列化合物中的11g(MIC=4 μg/mL)表现出最强抗菌活性,比克拉霉素(MIC>256μg/mL)提高了 64 倍;对于耐药型S.aureus ATCC43300,化合物 11g(MIC=4μg/mL)和 B系列化合物中的20m(MIC=4μg/mL)抗菌作用最强,比克拉霉素(MIC>256μg/mL)提高了 64倍;对于ermB耐药型S.pneumoniaeB1,A系列化合物中的11d、11f 和 11g(MIC=8 μg/mL)、B 系列化合物中的 20m 和 20n(MIC=8μg/mL)和C系列化合物中的36m和36n(MIC=8 μg/mL)具有最强的抗菌活性,比克拉霉素(MIC>256 μg/mL)提高了 32倍;对于mefA+ermB耐药型S.pneumoniae AB11,化合物 11g(MIC=4μg/mL)和 36m(MIC=4μg/mL)具有最强的抗菌活性,比克拉霉素(MIC=128μg/mL)提高了 32倍;对于耐药型S.pyogenes 1,A系列化合物中的11e-g(MIC=8 μg/mL)、B系列化合物中的20m和 20n(MIC=8μg/mL)和 C 系列化合物中的 36k、36m 和 36n(MIC=8 μg/mL)表现出最强的抗菌活性,其活性比克拉霉素(MIC=256 μg/mL)提高了 32倍。综上所述,化合物 11f、11g、20m、20n、36m 和 36n 对于耐药型S.aureus ATCC31007、耐药型S.aureus ATCC43300、ermB 耐药型S.pneumoniae B 1、mefA+ermB 耐药型S.pneumoniae AB11和耐药型S.pyogenes 1均表现出强力和均衡的抗菌活性(MIC=4～8 μg/mL),具有抗菌谱广的优点。根据以上抗菌活性结果,我们对A-E系列化合物的构效关系总结如下:(1)芳烷基侧链连接在15元内酯环的C-13位对提高目标化合物的抗敏感菌活性效果最好,N-11位次之,C-12位最差;(2)增加芳烷基侧链和15元内酯环之间的距离可以提高目标化合物的抗敏感菌活性;(3)与目标化合物相比,克拉霉素对耐药菌几乎没有活性,说明芳烷基侧链是提高目标化合物抗耐药菌活性的必需基团;(4)芳烷基侧链在内酯环的连接位置会使A-E系列化合物表现出活性差别。当芳烷基侧链连接在N-11、C-12或C-13位时,这有利于提高目标化合物的抗耐药菌活性。但是当连接在C-9位时对耐药菌的活性基本丧失;(5)当芳烷基侧链末端连接的基团是给电子基、吸电子基或无取代基时,以给电子基中的烷基对提高化合物的抗耐药菌活性贡献最大。同时烷基链越长,抗耐药菌活性越强,当达到5个碳原子长度时,抗耐药菌活性最强。我们选择A系列化合物中的11f和11g、B系列化合物中的20m和20n、C系列化合物中的36k、36m和36n和D系列化合物中的49g,测定它们对mefA+ermB耐药型S.pneumoniae AB11的最低杀菌浓度(MBC)。研究表明它们均是通过抑制细菌的生长而发挥抗菌活性。此外,还测定了 C系列化合物中的36g、36h和36j和D系列化合物中的49b、491和49v对敏感型S.aureus ATCC25923的MBC值。研究结果表明它们也是通过抑菌机制发挥抗菌作用。为了进一步了解它们的杀菌动力学性质,我们绘制了化合物11g和36k对mefA+ermB耐药型S.pneumoniae AB11的时间杀菌曲线。研究结果表明化合物11g在高于或等于1 MIC浓度时,0-12小时表现出一定程度的杀菌作用,并且具有浓度和时间依赖性,在12-24小时则表现出优良的抑菌作用。同样,化合物36k也表现出与11g类似的杀菌动力学性质。综上所述,所测试的化合物均是优良的抑菌剂。选择C系列化合物中的36g、36h和36j和D系列化合物中的49b、491和49v,以克拉霉素作为对照,使用MTT法测定了它们对人乳腺癌细胞MCF-7的毒性。研究结果表明上述化合物对敏感型S.aureus ATCC25923和B.subtilis ATCC9372的抗菌活性是有效的,可以排除毒性因素。对四代大环内酯类抗生素的研发历程的充分认识,其作用机制和耐药机制的深刻理解,以及对其结构修饰和活性之间关系的精准把握,这些均为我们采用“片段切割和结合”设计策略奠定了坚实的基础。我们以克拉霉素为原料,以改变大环内酯母核结构和引入芳烷基侧链等设计策略,设计、合成了 5个系列的新型N-11,C-12,C-13和C-9位芳烷基克拉霉素半合成衍生物。在抗菌活性评价中发现多个具有优良抗菌活性的化合物,例如化合物11g(MIC=4μg/mL)对mefA+ermB耐药型S.pneumoniae AB11的抗菌活性显著,明显优于克拉霉素(MIC=128μg/mL),可作为先导化合物进一步研究。在此基础上,我们对所有目标化合物进行了合理的构效关系分析和总结,发现了内酯环、芳烷基侧链类型、芳烷基侧链在内酯环上的连接位置和连接位置手性碳的构型与抗菌活性之间的相互关系,为进一步的结构优化提供了理论依据。因此,上述研究结果有助于今后发现更多具有全新结构类型的大环内酯类衍生物以应对日益严重的细菌耐药性问题。