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水稻是世界上重要的粮食作物,也是单子叶模式植物。水稻基因功能的研究对提高水稻的产量和品质具有重要意义。CRISPR/Cas9技术是一种非常重要的基因编辑技术,可以实现基因的定点编辑,它在作物遗传改良和基因功能研究中有着重要作用。目前,CRISPR/Cas9技术在水稻中的应用非常普遍,许多实验室通过CRISPR/Cas9介导的方法对水稻中的基因进行了精确编辑。然而,大多数技术会将来自农杆菌的T-DNA整合到植物基因组中,这会导致可遗传的外源DNA元件转化到宿主植物中。在这个课题中,我们研究了一种有潜力的用于快速获得Cas9-free水稻植株的方法。我们回顾农杆菌相关文献发现,农杆菌的毒蛋白基因VirD2的ω域介导外源DNA整合到植物基因组,而VirD5基因的缺失影响农杆菌的稳定转化,但不影响其瞬时转化。因此,我们去除了农杆菌EHA105的VirD2基因的ω结构域,然后,与VirD5基因缺失的农杆菌菌株一起介导水稻转化,使用了3种测试方案获得Cas9-free的突变水稻植株。方案一中,我们在水稻组培的抗性筛选过程中分了3种情况进行实验:第一种是两次筛选时都加入潮霉素处理,第二种是第一次筛选时加入潮霉素处理一周,第二次筛选时不加入潮霉素处理,第三种是两次筛选时都不加入潮霉素处理,3种情况都没有得到Cas9-free的突变植株。方案二在方案一的基础上进行了改进,在组培的抗性筛选过程中分了2种情况进行实验:第一种是第一次筛选时加入潮霉素处理3天,第二次筛选时不加入潮霉素处理,第二种是两次筛选时都不加入潮霉素处理,同时选择新的CRISPR质粒用于实验,并且扩大了组培的规模。方案二中我们成功地从2688株组培苗中得到了8个定点突变植株,其中4个为Cas9-free突变植株,占到了突变株系50%的比例,但是植株的整体突变效率有待提高。我们认为完成组培筛选过程后,突变的愈伤组织占整个愈伤组织的比例太低是导致植株突变率低的主要原因,因此,我们设计了方案三。方案三中,我们去除了组培时的筛选过程,完成侵染,共培养和水洗的步骤后,直接进行分化实验。方案三的结果并不理想,我们只从565株组培苗中得到了1株带有Cas9基因的突变植株,没有得到Cas9-free的组培苗。因此关于如何提高直接获得无转基因的、并且实现了基因编辑的组培苗的效率的问题仍然需要继续深入研究。