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内质网(endoplasmic reticulum,ER)应激在肝炎-肝硬化-肝癌演变过程中起着重要的作用。MANF基因是对内质网应激最敏感的基因之一,MANF蛋白是一个分泌蛋白,分子量大小约20 k D,内质网应激可上调MANF的表达与分泌。AP-1在肿瘤发生中起着重要作用,同时也已经有研究显示AP-1蛋白具有肿瘤抑制作用。目前关于AP-1能否调控MANF的转录和表达以及AP-1调控MANF的表达对肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响尚未见报道。目的:观察转录因子AP-1能否调控MANF转录及翻译,明确AP-1调控MANF表达对肝癌细胞增殖、侵袭以及迁移能力的影响。方法:在BEL-7402和SMMC-7721肝癌细胞株中,过表达和沉默AP-1后,Real-time PCR以及Western blot方法检测MANF表达水平的变化。采用DBTSS和TESS软件分析人MANF基因上游启动子区,了解有无AP-1可能的结合位点。双荧光素酶报告实验检测AP-1对MANF启动子活性的影响。采用染色质免疫共沉淀实验检测AP-1与MANF启动子能否结合。平板克隆以及软琼脂克隆形成实验检测AP-1对BEL-7402和SMMC-7721肝癌细胞增殖能力的影响;采用Transwell侵袭实验检测AP-1对BEL-7402和SMMC-7721肝癌细胞侵袭和迁移能力的影响。同时收集肝癌患者的肝癌组织,免疫组化方法检测肝组织中MANF及AP-1的表达水平。在人肝癌组织中采用免疫荧光双标方法检测MANF与AP-1是否存在细胞内的共定位,并分析两者的相关性。结果:1.过表达AP-1上调肝癌细胞MANF的表达BEL-7402和SMMC-7721肝癌细胞中转入c-fos或c-jun质粒,Real-time PCR实验检测MANF m RNA的表达,结果显示肝癌细胞中MANF m RNA水平升高,Western blot检测显示肝癌细胞中MANF蛋白表达升高。2.沉默AP-1下调肝癌细胞MANF的表达BEL-7402和SMMC-7721肝癌细胞中转入c-fos-或c-jun-si RNA沉默内源性的c-fos或c-jun后,Real-time PCR实验显示肝癌细胞中MANF m RNA水平降低,Western blot检测显示肝癌细胞中MANF蛋白水平下降。3.软件分析显示人MANF基因上游启动子区域存在AP-1的结合位点将MANF基因上游5’端非翻译区序列输入DBTSS(http://dbtss.hgc.jp/)网络分析软件,预测其转录起始位点。之后,我们又提取预测转录起始位点上游1000 bp和下游200 bp的序列输入TESS(http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess)网络分析软件,分析MANF上游转录因子结合位点(TSS),发现其TSS上游分布着多个转录因子AP-1的潜在结合位点。4.AP-1增强MANF的转录活性将人MANF基因上游5’端启动子区(-880/+83,包括三个潜在AP-1结合位点)克隆到p GL3-Basic质粒中构建p GL3-h MANF(-880/+83)双萤光素酶报告基因载体;同时构建了删除AP1-1结合位点的截短体p GL3-h MANF(-423/+83)和同时删除了三个潜在结合位点的截短体p GL3-h MANF(-256/+83)。在培养的肝癌细胞BEL-7402中共转染AP-1和p GL3-h MANF(-880/+83)或其截短体。结果显示:AP-1可以增强p GL3-h MANF(-880/+83)以及p GL3-h MANF(-423/+83)的萤光素酶的活性,但不能增强p GL3-h MANF(-256/+83)截短体的活性,且p GL3-h MANF(-880/+83)和p GL3-MANF(-423/+83)的萤光素酶的活性没有显著性差异。该结果提示AP1-1对MANF的转录活性没有影响,可以排除AP1-1这一结合位点。为了明确AP1-2和AP1-3对MANF转录活性的影响,进一步构建了含AP1-2突变及含AP1-3突变的质粒。然后将突变质粒转染肝癌细胞BEL-7402中。结果显示:AP1-2结合位点突变后,p GL3-h MANF(-880/+83)的萤光素酶活性显著降低,而AP1-3结合位点突变后,p GL3-h MANF(-423/+83)的萤光素酶活性不受影响。上述结果提示AP1-2可以增强人MANF基因的转录活性。5.AP-1能结合到MANF启动子区正常培养的肝癌细胞,分离细胞核,分别用抗c-fos或c-jun抗体进行染色质免疫共沉淀实验,并将沉淀下来的DNA用MANF启动子的引物进行PCR。琼脂糖电泳显示c-fos或c-jun可以分别与MANF的启动子区结合。6.c-fos或c-jun抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力;平板克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验以及Transwell侵袭实验结果显示:过表达c-fos或c-jun后,MANF表达上调,同时可抑制肝癌细胞平板克隆形成和软琼脂克隆形成能力,抑制肝癌细胞的侵袭和迁移能力;相反,转染c-fos-或c-jun-si RNA后,MANF表达下调,伴有肝癌细胞克隆形成能力增强,肝癌细胞的侵袭和迁移能力增强。上述结果提示AP-1可能通过正调控MANF的表达抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移能力。7.人肝癌组织中c-fos或c-jun表达及与MANF的共定位收集10例肝癌患者肝组织,免疫组化方法检测结果显示:5例肝癌患者的肝癌组织中c-fos呈现低表达,4例肝癌患者的肝癌组织中c-jun呈现低表达,且在c-fos和c-jun呈低表达的肝癌组织中,MANF的表达也降低,两者呈现出一致性变化;免疫荧光双标实验显示:在人肝癌组织中,MANF与c-fos或c-jun在细胞内存在共定位。结论:转录因子AP-1的亚单位c-fos或c-jun正调控人MANF基因的表达并可能通过正调控MANF抑制肝癌细胞的增殖、侵袭以及迁移能力。