论文部分内容阅读
CD86（又称B7-2）是表达在抗原提呈细胞（antigen-presenting cell，APC）表面的重要共刺激分子，其受体是表达在T细胞表面的CD28分子。CD86与CD28结合转导的信号，对T细胞的活化、增殖与功能发挥起着重要作用。CD86的编码基因为1120bp，由306个氨基酸组成，属于Ⅰ型跨膜糖蛋白。单链抗体（single chainvariable fragment，scFv）是一种新型重组抗体，是将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）用一条弹性短肽连接而成的小分子抗体片段，此类抗体的优点是分子量小、免疫原性弱、渗透性强、并具有药物导向及中和毒素等功能。本研究在成功制备了鼠抗人CD86单克隆抗体及其相应人-鼠嵌合抗体的基础上，构建了抗人CD86-scFv的真核表达载体并在CHO细胞中得到稳定表达，进而对该抗体的生物学功能进行了初步研究。第一部分抗人CD86单链抗体（CD86-scFv）的构建及表达目的：构建抗人CD86-scFv基因并在CHO细胞中表达，筛选稳定表达该抗体的细胞株。方法：采用RT-PCR从分泌鼠抗人CD86单克隆抗体的杂交瘤细胞株（克隆号：1D1）中克隆VH及VL基因。重叠延伸拼接PCR（gene splicing by overlap extensionPCR，SOE-PCR）方法构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因，并克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP。脂质体转染法转染至中华仓鼠卵巢细胞（CHO），G418加压筛选，采用流式细胞术鉴定出稳定表达抗人CD86-scFv的细胞株。结果：构建的抗人CD86-scFv基因全长为780bp，测序后经BLAST比对，证明该序列为鼠源亲本抗体的可变区基因，并含有信号肽、连接肽以及His标签。转染CHO细胞，G418加压筛选后获得了稳定表达抗人CD86-scFv的细胞株，命名为SA-IV。培养上清与L929-CD86细胞的阳性结合率为64.8%。结论：成功构建了稳定表达抗人CD86-scFv的细胞株SA-IV，为进一步研究该抗体的生物学活性提供了物质基础。第二部分抗人CD86-scFv的生物学功能研究目的：制备抗人CD86-scFv，分析其与不同人源细胞株膜型CD86分子的结合特性及介导的生物学功能。方法：大批量培养细胞株SA-IV，收集上清，ProfinityTMIMAC镍预装柱分离纯化CD86-scFv。采用流式细胞术分析CD86-scFv对基因转染细胞株L929-CD86以及天然表达CD86分子的人B系淋巴瘤细胞Raji和Daudi膜型CD86分子的识别。竞争抑制实验分析该抗体与鼠源亲本抗体1D1竞争结合相应抗原的能力。在Raji细胞的培养体系中加入不同浓度的CD86-scFv，MTT法分析CD86-scFv对Raji细胞增殖的影响，流式细胞术分析该抗体诱导Raji细胞凋亡的作用。CD86-scFv与Raji细胞共孵育后接种BABL/c裸鼠，观察抗体对肿瘤细胞成瘤性的影响。结果：经大量培养SA-IV并收集培养上清，镍预装柱分离纯化CD86-scFv的得率为4.2mg/L。CD86-scFv能特异性识别L929-CD86、Raji以及Daudi细胞表面的CD86分子，阳性结合率分别为67.0%、72.3%及80.5%。该抗体对鼠源亲本抗体1D1具有竞争结合能力。在Raji细胞培养体系中加入CD86-scFv，细胞生长抑制率为28.3%，凋亡率为11.2%。Raji细胞与CD86-scFv共孵育后接种BALA/c裸鼠，成瘤（直径4-5mm）时间较对照组推迟6-8天，在60天的观察期内，抗体处理组肿瘤的平均体积较对照组小30%。结论：研制的抗人CD86-scFv能够与相应抗原分子结合，体内、外对高表达CD86分子的肿瘤细胞均具有生长抑制作用。