前言:膀胱癌是人类泌尿系统恶性肿瘤中最为常见的一种。在过去的几十年里,即使传统治疗方法在不断发展,但找到新的分子靶点,开发新的靶向治疗对于提高患者的长期生存率至关重要。Rab11是Rab小分子GTP酶家族的一个成员。在细胞执行内吞再循环作用过程当中,Rab11是必不可少的关键因子,它能够调控Rac活性的相对水平,并且在多细胞运动型结构形成过程中有利于单个细胞的形成。Rab11在有丝分裂纺锤体的生成和定向过程也发挥重要作用。但Rab11是否在人类恶性肿瘤细胞中发挥功用,发挥怎样的功用至今还未研究透彻。根据文献报道,在结直肠癌细胞中,Rab11能够上调E-cadherin的表达量,诱导癌细胞的转化过程,提示我们Rab11可能作为一个肿瘤蛋白而存在。在本课题研究过程中,我们通过免疫组织化学方法检测了Rab11在膀胱癌细胞中的临床意义。在膀胱癌细胞系中对Rab11进行双向调控,分析Rab11对细胞增殖,侵袭,细胞周期以及凋亡的影响。此外,我们还探究了Rab11发挥其生物学功用所依赖的分子信号通路。材料和方法:1、临床样本此次研究获得了中国医科大学的批准。组织样本取自于159例膀胱癌患者,这些患者在2010-2014年间在中国医科大学附属第四医院被确诊。样本的组织学分级以及肿瘤分期是由病理学专家根据WHO分类原则进行鉴定。根据WHO分类原则肿瘤被分为Ta,T1,T2,T3,T4期。2、免疫组织化学肿瘤样本用10%的福尔马林固定,采用4μm石蜡切片。免疫组织化学方法采用S-P法,试剂盒购于Maixin(UltrasensitiveTM,Mai Xin,Fuzhou,China)。一抗为Rab11兔抗(1:300 dilution,Proteintech,USA),4°C孵育过夜。用DAB(Mai Xin,Fuzhou,China)试剂盒进行显色,苏木精进行复染,然后经过乙醇脱水,封片。Rab11细胞质染色强度记分原则为:0(无着色),1(弱着色),2(强着色)。百分比估测原则:1:1–25%,2:26–50%,3:51–75%,4:76-100%。取两项得分的乘积,小于4则为阴性或弱阳性,大于4则为阳性。3、细胞培养及转染本实验所用膀胱癌细胞系为RT4,BIU-87,5637以及T24,均购于美国模式培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA,USA)。基因敲除(si RNA)所用转染试剂为Dharma FECT1(Dharmacon,CO,USA)。Rab11 ONTARGETplus si RNA购于Dharmacon公司(Dharmacon,CO,USA)。阴性对照使用Non Targeting si RNAa。本实验所用质粒为p CMV6-Rab11,购于Origene公司(Origene,Rockville,USA)。阴性对照为p CMV6。本实验所用NF-κB信号通路抑制剂为BAY 11-7082(Sigma,USA)。4、Western blot提取样品总蛋白的过程中采用Pierce裂解缓冲液,目标蛋白定量参照Bradford方法。SDS-PAGE电泳上样量为20 mg,电泳完成后转印于PVDF膜(Millipore,MA,USA)。转印后孵育一抗,条件为4°C过夜,所用一抗及相应稀释比例为:Rab11(1:800,Proteintech,USA),p-IκB,cyclin D1,cyclin E,MMP9,Bcl-2(1:1000;Cell signaling,Boston,MA,USA),mouse monoclonal antibody against b-actin(1:2000;Santa Cruz)。二抗为辣根过氧化物酶结合的兔抗或鼠抗Ig G(1:1000 dilution,Cell Signaling Technology,USA),37°C孵育2小时。发光试剂盒采用Pierce ECL试剂盒,发光仪器为DNR Bio Imaging System(DNR,Jerusalem,Israel)。5、实时定量PCRqRT-PCR所用试剂盒为SYBR Green master mix kit,购于Applied Biosystems公司。所用PCR仪为Applied Biosystems公司生产7500 Real-Time PCR System。PCR扩增过程中所用内参为β-actin。基因表达的相对量用ΔCt值代表,其中ΔCt=Ct gene-Ct reference,基因扩增倍数的估测方法采用2-ΔΔCt估测法。该实验进行三次重复。本实验所用引物序列如下:cyclin D forward,5’-TGGAGGTCTGCGAGGAACA-3’,cyclin D reverse,5’-TTCATCTTAGAGGCCACGAACAT-3’;cyclin E forward,5’-AGCCAGCCTTGGGACAATAAT-3’,cyclin E reverse,5’-GAGCCTCTGGATGGTGCAAT-3’;MMP9 forward,5’-CCTCTGGAGGTTCGACGTGA-3’,MMP9 reverse,5’-TAGGCTTTCTCTCGGTACTGGAA-3’;β-actin forward,5’ ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC 3’,β-actin reverse,5’ CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG 3’。6、CCK-8细胞活性实验采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒,按照产品说明操作,分析细胞的增殖速度。将转染质粒或者si RNA的细胞培养48小时后,接种于96孔板中,接种密度约为6×103/孔。检测细胞增殖率前加入10μl CCK-8溶液处理细胞4小时,接着通过酶标仪分析细胞增殖率及存活率变化,选用波长为490 nm。7、荧光素酶报告基因实验NF-κB报告质粒(0.2μg)购于Beyotime公司。Renilla luciferase报告质粒购于Promega公司。所用转染试剂为Attractene reagent(Qiagen,Germany)。转染后30小时加入荧光素酶报告试剂并检测荧光素酶活性。8、细胞周期分析实验PBS缓冲液漂洗细胞,用浓度为5 mg/ml的碘化丙啶进行染色,室温持续30分钟。分析所用仪器为BD FACS Calibur flow cytometer systems。9、基质胶侵袭实验首先将24孔Transwell小室铺膜,用20μl Matrigel(1:4 BD Biosciences,CA,USA)进行铺膜。进行苏木精染色,室温干燥过夜,显微镜下对细胞进行计数,实验重复3次,取均值。10、Annexin V-FITC细胞凋亡检测采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒,按照产品说明操作,分析细胞的凋亡率。将转染质粒或者si RNA的细胞培养48小时后,加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞,并离心收集细胞,在细胞中先后加入5μL Annexin V-FITC和5μL碘化丙啶染色液,室温避光孵育15min。随即进行流式细胞仪检测,Annexin V-FITC为绿色荧光,碘化丙啶(PI)为红色荧光。11、统计分析统计分析所用软件为SPSS。临床病理数据分析采用c2检验方法。光密度数据分析比较采用t检验法。p<0.05为存在显著差异。结果:1、在人原发性膀胱癌组织标本中检测Rab11表达情况,并分析Rab11与临床病理特征间的相关性通过免疫组织化学方法对159例原发性膀胱癌样本进行检测,其中66例膀胱癌组织样本中Rab11存在过表达的现象,并且Rab11定位于细胞质。我们分析了Rab11的表达情况与临床病理因素的相关性,结果表明:Rab11过表达与膀胱癌细胞的侵袭状态显著相关(Ta-T1 vs T2-T4,p=0.004)。2、在人原发性膀胱癌细胞系中用双向调控的方法检测上调或下调Rab11后对细胞增殖的影响为了探究Rab11在膀胱癌细胞中的生物学作用,我们设计将Rab11质粒转染于BIU-87细胞系,将Rab11 si RNA转染于T24细胞系。实验结果表明:Rab11转染后能够促进膀胱癌细胞的增殖,提高癌细胞的增殖率,而敲除Rab11后则能够抑制膀胱癌细胞的增殖。3、在人原发性膀胱癌细胞系中用双向调控的方法检测上调或下调Rab11后对细胞周期的影响细胞过表达Rab11后,G1期所占百分比明显降低,S期所占百分比上升,cyclin D1和cyclin E的表达量有了明显提高。细胞干扰Rab11后,G1期所占百分比明显上升,S期所占百分比下降,cyclin D1和cyclin E的表达量显著下降。这些结果都表明在膀胱癌细胞中,Rab11调控细胞周期相关蛋白的表达,进而调控细胞周期进程。4、在人原发性膀胱癌细胞系中用双向调控的方法检测上调或下调Rab11后对细胞侵袭的影响我们通过基质胶侵袭实验,来探究Rab11对膀胱癌细胞侵袭能力的影响。转染Rab11过表达质粒的细胞系,其侵袭能力显著增强,细胞中MMP9的表达量显著上调。敲除Rab11后的细胞系,穿过基质胶的细胞数目明显减少,细胞中MMP9的表达量明显下调。5、在人原发性膀胱癌细胞系中用双向调控的方法检测上调或下调Rab11后对NF-κB信号通路活性的影响荧光素酶报告实验表明Rab11转染增强NF-κB信号通路活性并上调p-IκB的蛋白表达量,Rab11干扰减弱NF-κB信号通路活性并下调p-IκB的蛋白表达量。此外,NF-κB抑制剂能够削弱Rab11对cyclin D1以及MMP9蛋白表达的影响。6、通过顺铂诱导凋亡后,在人原发性膀胱癌细胞系中用双向调控的方法检测上调或下调Rab11后对细胞存活率和凋亡率的影响我们在人原发性膀胱癌细胞BIU-87和T24中加入2μm的顺铂处理24-48小时诱导凋亡。CCK8实验结果显示抑制Rab11可以明显减少人原发性膀胱癌细胞的存活率,过表达Rab11可以明显增加细胞的存活率;Annexin V-FITC细胞凋亡双染实验显示抑制Rab11可以明显增加人原发性膀胱癌细胞的凋亡,转染Rab11可以明显减少细胞的凋亡率。7、通过检测细胞凋亡相关蛋白来探讨Rab11影响膀胱癌细胞凋亡的可能机制我们用Western Blot方法检测人原发性膀胱癌细胞中Rab11水平变化对凋亡抑制因子Bcl-的影响。结果显示,Rab11敲除可以显著减少凋亡抑制因子Bcl-2的表达,而转染Rab11可以明显增加凋亡抑制因子Bcl-2的表达。结论:1、Rab11在膀胱癌组织中过表达(66/159),其过表达与膀胱癌细胞的侵袭深度密切相关(p=0.004)。2、Rab11促进人原发性膀胱癌细胞的增殖和侵袭能力。3、Rab11促进人原发性膀胱癌细胞中cyclin D1,cyclin E和MMP9的m RNA和蛋白表达。4、Rab11增强NF-κB信号通路活性,并通过该通路影响cyclin D1和MMP9的表达。5、Rab11增加人原发性膀胱癌细胞经顺铂诱导后的存活率,减少细胞的凋亡率。6、Rab11促进人原发性膀胱癌细胞中Bcl-2的蛋白表达。