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铁是人体的必需微量元素。铁参与多种生理代谢过程,如氧化代谢、红细胞生成、免疫应答等。但过量的铁具有细胞毒性,细胞内外的铁离子浓度通过调节转入和运出得以平衡。转铁蛋白(ferroportin,FPN)是目前哺乳细胞中唯一已知的铁转出转运体。转铁蛋白功能异常会引发转铁蛋白病或4型血色病。然而膜蛋白表达和纯化的困难使得执行精确的生物化学和生物物理实验十分困难,进而阻碍了人们对转铁蛋白分子水平上的铁转运和调控机制的理解。尽管细菌同源体BbFPN的结构得到了解析,但由于BbFPN和人源转铁蛋白只有24%的一致性和40%的相似性,BbFPN能提供的人源转铁蛋白(Human ferroportin,hFPN)结构信息十分有限。而在缺乏模板情况下提出的hFPN分子结构模型需要确切的实验检验。 真核转铁蛋白的高保守性为通过哺乳类转铁蛋白研究人源转铁蛋白提供了合理性。在早期蛋白表达筛选的基础上,本论文展示了异源表达和纯化菲律宾眼镜猴(Tarsius syrichta)的转铁蛋白(Monkey ferroportin,mFPN)的过程,表明了纯化的mFPN蛋白对二价铁和钴离子的有结合和转运活性。进一步的研究表明mFPN对二价离子的亲和性在pH6.0时基本丧失,说明离子的结合位点有可能是由酸性氨基酸侧链组成。 用mFPN作为模型,本论文研究了两个人类致病性遗传突变体N174I和D181V的功能。我表达纯化了突变体并测量它们对底物转运活性及结合亲和力。实验发现N174I突变体在转运速率和底物结合亲和力上都出现显著性降低,这说明它可能是直接影响底物的结合。D181V转运活性出现显著降低,但底物结合亲和力却没有降低,这意味着该突变可能通过影响FPN构象变化来阻碍转运。以上实验结果从分子水平上阐释了这两种突变引起疾病的发病机理。 用细菌同源体BbFPN的结构作为模板,发现mFPN上S35、D39、H43、T150、D181、E219、D325和R466有可能会跟底物结合位点有关。进一步对这些位点进行突变,表达纯化突变体并测量它们对底物转运活性及结合亲和力。实验发现这些突变对底物的亲和力都不发生变化,但是大部分的突变体降低底物的转运速度。这些实验结果说明细菌同源体BbFPN的结构跟哺乳类FPN的结构可能会有较大的差异。 本研究从分子层面上加深了我们对FPN转运底物的理解,为铁代谢调控提供了思路。