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自然杀伤性细胞（NK）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在机体免疫防御系统中与中性粒细胞、巨噬细胞一起发挥着至关重要的作用。抗菌肽NK-lysin存在于机体NK细胞和CTL细胞中，和人类的颗粒溶素（GNLY）是同源多肽，是天然免疫反应的主要组成部分，是连接适应性免疫反应和获得性免疫反应的纽带。近年来，抗生素药物的滥用使药物残留和细菌耐药性问题日益严重，严重威胁着畜牧业发展和人类健康，新型抗菌药物的研发成为迫切需要。抗菌肽成为新型抗菌药物研发的理想选择，在替代传统抗生素方面有着潜在的应用价值，具有广阔的市场前景。NK-Lysin的同源物颗粒溶素的研究已经进入临床阶段，而对NK-Lysin的功能和应用研究则较少。本研究探索绵羊NK-Lysin的原核表达方法，并分析其抗菌核心区域的结构和功能，通过化学合成绵羊抗菌肽NK-Lysin蛋白的主要功能多肽，检测合成多肽的抑菌谱和抑菌活性，利用雏鸡感染治疗模型验证绵羊抗菌肽对细菌感染的治疗作用，为绵羊抗菌肽NK-Lysin的功能研究和临床应用提供了科学资料。1、绵羊抗菌肽NK-Lysin的原核表达分析根据本实验室克隆的绵羊NK-Lysin基因GenBank（登录号为JX559777）序列设计引物，扩增绵羊NK-Lysin成熟肽基因（NK-Lysin-X）片段连接到pGEM-T载体，对重组载体进行酶切和测序验证，将验证正确的目的基因插入至原核表达载体，转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取阳性单菌落，重新摇菌活化，加入IPTG诱导表达。结果成功构建重组载体pET28a-NK-Lysin-X， pET30a-NK-Lysin-X， pET32a-NK-Lysin-X， pGEX-4T1-NK-Lysin-X，但NK-Lysin并没有在大肠杆菌中诱导表达，这可能与绵羊抗菌肽NK-Lysin的氨基酸组成和生物学功能相关。2、合成绵羊抗菌肽NK-Lysin的功能区多肽和生物学功能检测鉴于绵羊抗菌肽NK-Lysin在大肠杆菌中未能表达，本研究根据绵羊抗菌肽NK-Lysin的蛋白质二级结构预测及活性区域结构分析。利用生物信息学软件（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/和http://swissmodel.expasy.org/）分析、设计3段绵羊抗菌肽NK-Lysin核心区段，分别命名为NK7652-10、NK559777-18、NK7652-23，同时测定其抗菌谱和最小抑菌浓度，通过MTT法测定其对肿瘤细胞的杀伤活性。结果表明：合成多肽的长度、分子中螺旋结构、Loop环状结构、分子内二硫键对多肽的活性是必不可少的；NK55977-18和NK7652-23均对大肠杆菌、沙门氏菌有明显的抑菌活性，NK-55977-18对金黄色葡萄球菌有微弱抑制作用，NK7652-10对三种菌均无明显抑制作用；NK559777-18、NK7652-23对人肺腺癌细胞有明显的抑制作用。3、合成抗菌肽NK559777-18、NK7652-23对雏鸡沙门氏菌感染的治疗研究为了验证合成绵羊NK-Lysin NK559777-18、NK7652-23对雏鸡治疗的作用，建立雏鸡沙门氏菌感染模型并进行抗菌肽治疗实验。活化沙门氏菌后通过滴鼻、腹腔注射方式定量接种雏鸡，感染组随机分为A、B、C、D四组：A组不进行治疗，B组皮下注射多肽NK559777-18，C组皮下注射多肽NK7652-23，D组皮下注射氨苄西林钠，记录各组的临床症状和死亡情况，剖检观察雏鸡内脏各器官病变及组织学变化，分析合成肽对雏鸡细菌感染的治疗效果。结果：A组在2h内全部死亡，B组在感染6h后的存活率为50%，C组存活率为100%，D组在感染6h后的存活率为0。说明多肽NK559777-18和NK7652-23对雏鸡沙门氏菌急性感染有显著治疗作用；病理组织观察表明多肽治疗组雏鸡心、肝、肾、肺与未治疗组相比病变明显降低。总之，本项研究通过化学合成绵羊抗菌肽NK-Lysin的主要功能区多肽，验证其抗菌谱和抑制肿瘤细胞的生物学功能，通过雏鸡沙门氏菌感染治疗试验证实合成多肽具有良好的治疗作用，为新型的抗生素替代药物研发提供了候选材料，为解决抗生素滥用和细菌耐药性问题提供了新的方向。