产酶溶杆菌OH11 (Lysobacter enzymogenes OH11)是本实验室从辣椒根际土壤中分离到的一株新型生防细菌。该菌属于黄单胞科,溶杆菌属,GC含量较高,并具有滑行能力。OH11能产生多种胞外酶,对多种植物病原菌均有较强的抑制能力,具有十分广阔的应用前景。本文的宗旨是研究与产酶溶杆菌OH11生防相关的次级代谢产物及surface motility的调控网络。几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶的功能已有文献报道。在本文中,我们通过基因敲除的方法,研究了产酶溶杆菌中另外两种重要胞外酶α-水解蛋白酶与纤维素酶的功能。平板拮抗实验显示,这两种胞外酶编码基因的缺失均不影响产酶溶杆菌OH11对病原菌的拮抗能力。这些结果表明,这两种胞外酶均不是OH11拮抗病原菌所必需的。热稳定抗真菌因子HSAF (heat-stable antifungal factor)是最近被报道的一种次级代谢产物。在产酶溶杆菌OH11中,我们构建了pks-nrps缺失突变株△pks。与野生型OH11相比,△pks失去了对病原菌的抑制能力,HSAF产量也显著降低。此外,从野生型OH11中提取的HSAF能抑制病原菌的生长,并且pks缺失并不影响几丁质酶等胞外酶的活性。这些结果表明：在产酶溶杆菌OH11中,HSAF是其生防功能的一个关键因子,并且pks-nrps是HSAF生物合成的一个关键基因。为了寻找HSAF生物合成的调控基因,我们将LacZ融合至产酶溶杆菌OH11的pks-nrps处,构建了工程菌株IH11-GP112.该菌株在含X-gal的平板上显示浅蓝色,并且具有与OH11相似的拮抗能力及HSAF产量。以OH11-GP112为出发菌株,利用Tn5转座子构建了转座子文库。实验表明,含Tn5转座子的OH11-GP112转化子菌落颜色变化与HSAF产量呈正相关性。根据这些结果,我们先通过菌落颜色变化来筛选HSAF产量明显下降的潜在菌株,以缩小筛选范围,再结合拮抗实验,筛选到拮抗能力显著减弱甚至消失的菌株,并通过亚克隆的方法鉴定了Tn5的插入位点。其中有一个转化子,Tn5插入位点位于Clp (cAMP-receptor like protein)编码基因clp中。我们构建了产酶溶杆菌OH11的clp基因缺失突变株△clp。与野生型OH11相比,△clp丧失了对病原菌的拮抗能力。HPLC检测显示,△clp中HSAF的产量显著下降。此外,clp缺失还影响了多种胞外酶的活性。在此基础上,我们利用转录组数据来分析Clp对下游基因的调控网络。转录组结果显示,Clp可以调控775个基因的表达,按照COG分类的方法,这些基因可分为19个类别。进一步分析发现,Clp可以调控20个假定基因簇的转录。从这些假定基因簇中,我们发现了与WAP-8294A2合成相关的基因簇,并通过实验证明了Clp可以调控WAP-8294A2的生物合成。Clp调控的20个假定基因簇中,有4个可能与细菌的运动能力相关,包括3个与IV型菌毛(Type IV pili, T4P)相关及1个与鞭毛合成相关的基因簇。通过基因敲除等手段,我们揭示了Clp可以通过T4P来调控surface motility,并且pilA是一个关键基因。随之,我们进一步揭示了Clp可以独立地调控HSAF、WAP-8294A2的合成及surface motility.在Xcc中,Clp可通过FhrR与Zur等因子来调控下游的一系列基因的表达。然而,我们在产酶溶杆菌OH11中并未发现FhrR的同源物,并且证明了Clp也不是通过Zur来调控次级代谢产物HSAF、WAP-8294A2的合成及surface motility.这些结果暗示产酶溶杆菌中Clp的调控网络与Xcc中存在着很大的差异。通过对Clp下游转录因子的研究,我们发现了2个新的因子Lat与Lys1456。Lat与Lys1456均受Clp调控,并且Clp可以与lys1456的启动子区结合。Lat、Lys1456分别与HASF、WAP-8294A2的合成有关,均与surface motility无关。此外,我们通过一系列实验,证明了Clp可以在过表达的情况下,不依赖于Lat来调控HSAF的生物合成。在此基础上,我们提出了产酶溶杆菌OH11中Clp的部分调控模型。