弧菌(Vibrio)是一类菌体短小、杆状或弧状的革兰氏阴性运动性细菌,广泛分布于自然界,以海洋、河口的咸水和淡水生态系统为主,其种类丰富、功能多样,在地球水生生态系统的生物、化学循环中发挥着重要作用。弧菌也是水产养殖中最常见、分布最广、危害最严重的病原菌之一。随着水产养殖业的发展,弧菌病的爆发越来越频繁,传播速度越来越快,给世界水产养殖业带来了巨大的经济损失。目前已知有12种人类致病性弧菌,包括副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、霍乱弧菌(V.cholerae)、辛辛那提弧菌(V.cincinnatiensis)、创伤弧菌(V.vulnificus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、拟态弧菌(V.mimicus)、梅契尼柯夫弧菌(V.metschnikovii)、霍利斯弧菌(V.hollisae)、海鱼弧菌(V.damsela)、河流弧菌(V.fluvialis)、弗尼斯弧菌(V.furnissii)和鲨鱼弧菌(V.carchariae)等。由于海水、淡水养殖环境中含有大量弧菌,各种天然和养殖的鱼类、贝类等水产品均可能受到弧菌污染,食用这些受弧菌污染的水产品易导致人类胃肠炎等疾病的爆发。流行病学调查显示致病性弧菌是我国沿海、沿江城市人群腹泻病的主要病原菌。江苏地区临近黄海,属于典型的温带气候,江河、海洋捕捞业和水产养殖业发达,水产品品种繁多、贸易频繁,是弧菌感染的高发地区。因此,本研究系统研究该地区水产品中弧菌菌群的分布、污染水平、致病特征、环境适应以及生物防治措施等,这对于了解该地区水产品中弧菌的分布规律、环境适应特征和制定有效的生物防控策略具有重要意义。1水产品中弧菌菌群多样性1.1高通量测序分析水产品中TCBS菌群多样性2014年秋季(11月初)从扬州市五大超市、农贸市场采集90份水产样品,按超市淡水产品(CSDS)、超市海水产品(CSHS)、农贸市场淡水产品(NMDS)、农贸市场海水产品(NMHS)分为四份混合样品,经3%氯化钠碱性蛋白胨水(Alkaline peptone water,APW)10倍稀释后涂布硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium,TCBS)平板富集弧菌;另取4份样品经APW过夜增菌后再涂布TCBS平板富集弧菌,过夜培养后刮取平板上所有菌苔提取细菌总DNA,通过16S rDNA 454焦磷酸测序分析不同水产品中可培养TCBS菌群。结果显示四类样品中TCBS菌群增菌前后在门、纲、目、科、属的水平上有较大差异,而海水、淡水、超市、农贸市场来源的水产品的菌群组成基本一致,但其构成比例有明显差异。4份水产品样品TCBS直接富集后的优势菌属依次是:弧菌属(Vibrio)、链球菌属(Streptococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、乳酸菌属(Lactobacillus)、梭菌属(Clostridium);而经APW增菌再由TCBS富集后的菌群有较大变化,其优势菌属主要有:硝化螺菌属(Nitrospira)、链球菌属(Streptococcus)、希瓦氏菌属(Shewanella)、独岛菌属(Dokdonella)、弓形杆菌(Arcobacter)、弧菌属(Vibrio)。1.2水产品中弧菌菌群分离、鉴定与致病性分析2015和2016年温暖季节(5-10月)从江苏部分地区随机采集225份水产品样品,通过生化鉴定、特异性基因扩增和16S rDNA PCR扩增对TCBS平板分离纯化出的1850株分离株进行鉴定,结果显示,江苏部分地区水产品中普遍存在弧菌污染现象,且污染弧菌种类具多样性。225份样品中共有195份样品被检出弧菌,弧菌总检出率为86.7%,各弧菌种的检出率分别为:V.parahaemolyticus 76.0%、V.alginolyticus 79.0%、V.harveyi1 3.0%、V.aestuarianus 7.5%、V.metschnikovii 6.3%、V.azureus 6.0%、V.natriegens 3.6%、V.diazotrophicus 2.7%和V.owensii 2.0%,其中副溶血弧菌和溶藻弧菌的分离率明显高于其他弧菌。从样品来源看,海水产品中弧菌的检出率(92.4%)明显高于淡水产品(82.4%),鱼类产品中弧菌的检出率(89.7%)略高于虾、贝类(83.1%);从采样地区看,沿海、沿江的弧菌检出率(88.2%)稍高于内陆地区(84.6%);而从采样场所看,农贸市场的检出率(96.0%)明显高于超市(76.8%)。通过对1850株分离株的tdh、trh基因扩增、神奈川试验和部分分离株的小鼠肠积水试验分析分离株的致病性,结果显示,1406株副溶血性弧菌分离株中,tdh+菌株13株、trh+菌株10株,阳性率分别为0.92%和0.71%;神奈川试验结果显示1850个弧菌分离株的溶血阳性率为49.32%;肠积水试验表明几乎所有受试菌株,尤其是tdh+、trh+菌株灌胃小鼠后均出现不同程度的小肠积水、肠壁充血效应(变红)。2胁迫生长条件下弧菌生物学特性及转录组分析2.1胁迫生长条件下弧菌生物学特性以副溶血性弧菌(CICC21617)和溶藻弧菌(CICC 10484)参考菌株为研究对象,研究其在不同盐度、pH值和温度等应激条件下的胁迫生长能力、细胞形态、生物被膜形成能力、溶血素活性等生物学特性。首先确定了应激培养条件:副溶血性弧菌(CICC 21617)能生长(OD600nm>0.3)的最低盐度为0.9%、最高盐度8.0%、最低pH5.0、最高pH10.0、高温45℃5 min、低温-20℃ 2 h;溶藻弧菌(CICC 10484)能生长(OD600nm>0.3)的最低盐度为0.5%、最高盐度8.0%、最低pH4.0、最高pH9.0、最高温度是50℃下5 min、低温-20℃ 下 2h。菌株在低盐、高盐、低pH和高pH液体培养基中能缓慢生长,但将胁迫株再接种入含3.0%NaCl的LB培养基时,其恢复生长能力出现较大差异,高、低pH与高、低温胁迫株恢复生长能力明显高于高、低盐胁迫株,表明胁迫株比未胁迫菌株更能应对相同的胁迫环境。电镜下,胁迫菌株出现明显的细胞壁凹陷、细胞表面破损等变化,严重者甚至出现细胞内容物外泄;2株受试弧菌经高温、高pH胁迫以及溶藻弧菌CICC 10484经高盐胁迫后细胞表面破损最为严重,细胞之间可见絮状物质凝聚。虽然副溶血性弧菌(CICC 21617)和溶藻弧菌(CICC 10484)原始菌株的生物被膜生成能力差异较大,但与未胁迫菌株相比,胁迫菌株的生物被膜生成能力的变化趋势完全一致。多数条件下胁迫株的生物被膜生成能力均有所提升,其中副溶血性弧菌(CICC 21617)低盐胁迫株的生物被膜生成能力最强,其次是低pH、高温、高pH;溶藻弧菌(CICC 10484)低pH、高pH、高温、低盐胁迫株的生物被膜生成能力也比未胁迫株强,但高盐和低温胁迫株的生物被膜生成能力却远远低于未胁迫菌株。副溶血性弧菌(CICC 21617)和溶藻弧菌(CICC 10484)经过各种胁迫传代培养后,溶血素活性均有所降低,尤其是低盐、低pH、高温胁迫株下降最为显著,与原代菌株相比,差异显著(P<0.05);而胁迫传代培养菌株产胞外蛋白酶的能力虽有所降低,但与原代菌株比差异并不显著。综上所述,2株受试弧菌经应激胁迫培养后其生长能力、抗逆境能力、细胞形态、生物被膜形成能力、溶血素活性等生物学特性均发生了较大的变化。2.2盐胁迫弧菌菌株的转录组学分析为了解弧菌应对盐胁迫条件的响应机制,采用RNA-seq技术,对经0.5%NaCl一次胁迫和连续胁迫20代以及常规LB(3.5%NaCl)培养的副溶血弧菌(CICC 21617)菌株进行了 Illumina HiSeq 2500转录组学分析。测序结果显示,一次胁迫培养组与未胁迫培养组相比,共有1240个基因的转录出现变化,其中上调基因637个,下调基因603个;连续传代20次胁迫组与未胁迫培养组相比共有1418个基因的转录出现了变化,其中上调基因715个,下调基因703个。这些差异表达基因主要参与氨基酸代谢、能量代谢、转运结合相关、细胞进程、定向运动等生物过程。通过KEGG通路分析,一次胁迫组与未胁迫组相比差异表达基因被富集到342条信号通路上,富集基因数量较多的通路有氨基酸代谢通路、能量代谢通路、转运结合相关通路等;连续传代20次胁迫组与未胁迫组相比差异表达基因被富集到296条信号通路上,富集基因数量较多的通路,与一次胁迫相似。3水产品中致病性弧菌噬菌体的分离鉴定与靶向抑菌3.1弧菌噬菌体的分离与生物学特性随着致病性弧菌对水产品带来的食品安全隐患日益加剧,迫切需要开发非药物天然生物抑菌剂来控制水产品中致病性弧菌的繁殖。以5株弧菌参考菌株(溶藻弧菌CICC 17749、副溶血性弧菌CICC 21617、拟态弧菌CICC 21613、霍乱弧菌CICC 23794、拟态弧菌CICC10383)为宿主菌从水产品污水中分离到27株噬菌体,筛选出3株具有跨种裂解特性的烈性弧菌噬菌体,其中Vmp 03、Vpp 07可裂解6个弧菌种的部分菌株,噬菌体Vap 04能裂解4个弧菌种的部分菌株。显微观察显示Vmp 03、Vpp 07为短尾噬菌体,Vap 04为肌尾噬菌体。噬菌体Vmp 03、Vpp 07、Vap 04的最适MOI分别为0.001、0.01、0.01,潜伏期分别为 20 min、30 min、20 min,裂解期分别为 50 min、50 min、60 min,裂解量分别为 60 PFU/cell、15.8 PFU/cell、7.9 PFU/cell;1 h 内能耐受的温度分别为 70℃、60℃、70℃,1 h 内能耐受的pH范围分别为4.0～10.0、6.0～10.0、4.0～12.0。上述裂解特性显示这3株噬菌体具有潜在的应用前景。3.2弧菌噬菌体Vmp 03的全基因组分析噬菌体Vmp 03和Vpp 07的全基因组测序结果显示,噬菌体Vmp 03基因组全长为43,479 bp,其中编码基因总长度为38403 bp,平均长度为936.66 bp,占总长的88.33%,GC含量为49.27%,有65个开放阅读框(ORFs)。噬菌体Vpp 07基因组全长为144768 bp,其中编码基因总长度为32592 bp,平均长度为931.2 bp,占总长的22.51%,GC含量为41.88%,有35个开放阅读框(ORFs)。噬菌体Vmp 03基因组编码40个预测的开放阅读框(ORFs),其中17个(42.5%)具有已知功能,包括7个结构蛋白(即支架蛋白,主要衣壳蛋白,门静脉蛋白,尾管蛋白A和B,内部核心蛋白和尾纤维蛋白),6种与DNA代谢相关的蛋白质(引发酶,DNA解旋酶,DNA指导的DNA聚合酶,核酸外切酶,核酸内切酶,DNA指导的RNA聚合酶)和4种成熟蛋白。3.3弧菌噬菌体的靶向抑菌应用LBS培养基和鱼汁模型,研究噬菌体Vmp 03、Vpp 07、Vap 04对3个敏感菌株(拟态弧菌CICC 21613、副溶血性弧菌CICC 21617和溶藻弧菌J 1-4)的抑菌活性。结果显示无论在LBS培养基还是在鱼汁模型中,噬菌体Vmp 03、Vpp 07、Vap 04均能有效抑制敏感菌株的生长,与对照组相比最高可以抑制3 log值CFU/mL的受试弧菌生长。生物被膜形成抑制实验表明噬菌体Vmp 03、Vpp 07、Vap 04能显著抑制敏感菌株生物被膜的形成。