论文部分内容阅读
DREB（dehydration resistance element binding protein）类转录因子是一类与抗逆相关的转录因子基因，广泛存在于各种植物中，参与调控各种与抗逆相关的功能基因的表达，在逆境胁迫应答反应过程中发挥非常重要作用。但是，目前对DREB基因的研究主要集中在功能分析方面，对其转录水平的调控机制了解比较少。
本实验室前期已经从大豆中克隆到新的GmDREB3基因，功能研究表明，过表达GmDREB3基因可以显著提高植物的抗逆性。将GmDREB3启动子分段缺失融合GUS报告基因采用基因枪转化小麦成熟胚愈伤组织，利用瞬时表达的方法检测不同长度启动子的活性的方法，对GmDREB3启动子进行初步分析证明，在启动子的-705～-1117bp区域存在着低温和干旱响应的正调控元件，在-1117～-1464bp区域存在着对低温和干旱响应的负调控元件。在此基础上，进一步对这两个重要区域进行了细致分析，结果证明在-705～-731bp区域存在着对低温和干旱响应的正调控MYB元件；-1117～-1269 bp区域存在着对低温和干旱响应起重要作用负调控MYC元件。本研究中我们利用确定的重要调控元件分别构建了诱饵载体，采用酵母单杂交技术，分别筛选与重要调控元件结合的上游调控蛋白：运用MYC元件做诱饵筛选到了GmERF蛋白，运用MYB元件作诱饵筛选到了GmMYB蛋白。我们分别采用酵母单杂交技术和凝胶迁移率实验验证了MYC元件与ERF元件可以和GmERF蛋白结合，MYB元件可以和GmMYB蛋白结合；通过酵母转化验证GmMYB蛋白具有转录激活活性，而GmERF蛋白不具有转录激活活性。通过RT-PCR对低温处理不同时间的拟南芥中的GmERF和GmMYB基因的表达特性进行了分析，发现相对表达量GmMYB呈下降趋势，GmERF呈上升趋势，一段时间后两者的表达量趋于稳定；通过酵母体内的两个蛋白之间的竞争性结合实验证明在GmMYB蛋白和GmERF蛋白表达量一致的情况下，GmERF蛋白先与GmDREB3启动子结合。为了确定GmERF和GmMYB基因的功能，我们分别构建了侵染植物的表达载体，结果分析表明，转GmMYB基因的拟南芥能明显提高植株的对干旱、NaCl等逆境胁迫的能力，转GmERF基因的拟南芥对干旱、盐等的胁迫呈现敏感的趋势。综上所述，在大豆低温处理3h内，GmMYB蛋白与MYB元件结合，激活DREB3基因的表达，从而激活下游抗逆基因的表达；在低温处理24h后，GmERF蛋白与MYC和ERF元件结合，抑制DREB3基因的表达，从而抑制下游抗逆基因的表达。正是由于正调控元件与负调控元件的相互作用使得GmDREB3基因在植物体内的表达水平维持在一个恰当的水平，使植物适应不良的外界环境并正常的生长。