论文部分内容阅读
急性肝胰腺坏死病（AHPND）是一种新出现的严重的对虾病，并且它是由含有毒性质粒的弧菌菌株引起的。该病已经造成了全世界对虾养殖业的大规模减产。所以一种高效准确的检测方法对于AHPND致病菌的检测和预防至关重要。在本研究中，基于副溶血弧菌OmpU建立了免疫磁珠捕获-PCR的方法用于检测AHPND致病菌株。得到的研究结果如下： 首先通过对AHPND致病菌外膜蛋白OmpU进行基因克隆，得到基因序列，然后对弧菌OmpU进行生物信息学分析，发现其在弧菌中高度保守，并且种内的保守性更高，存在多个共同抗原表位，所以推测OmpU在弧菌中具有交叉免疫原性，可以作为弧菌免疫分离的靶标。 进一步用已有的副溶血弧菌来源的OmpU的异源表达重组工程菌对目标蛋白进行表达纯化及验证后，制备多克隆抗体。然后用Western blotting和Whole cell ELISA分析副溶血弧菌OmpU在弧菌种内及种间的免疫学特性，结果显示副溶血弧菌OmpU抗体能与包括AHPND致病菌在内的弧菌产生种内、种间的交叉反应，与非弧菌细菌不产生或产生较弱的反应，同时Whole cell ELISA也证实了OmpU抗体能够识别弧菌的OmpU抗原表位。综合说明弧菌OmpU是一种交叉抗原，可以作为免疫磁珠分离的靶标，其抗体可以用来制备免疫磁珠分离弧菌。 以外膜蛋白OmpU用作免疫捕获靶标分离AHPND病原体，然后以AHPND质粒的两个毒性基因（pirA和pirB）的特异性片段作为PCR引物，研究建立弧菌免疫磁珠捕获-PCR检测体系。本研究首先评价了该体系检测性能：对制备的免疫磁珠进行了捕获效率的检测，发现对于AHPND致病菌的捕获效率均大于90％，并且纯培养的检测灵敏度均为101CFU/mL；而干扰实验表明在捕获缓冲液pH为3至9和盐浓度为1%至5%之间时免疫磁珠捕获-PCR检测体系仍然稳定；在非AHPND致病菌存在的情况下检测灵敏度没有显著差异。 进一步，通过实验室模拟建立水，沉积物和虾样品的人工感染模型，评价了免疫磁珠捕获-PCR检测体系的灵敏度仍然可达到相同的101CFU/mL。最后，在对实际环境样品检测的过程中，评价了该检测体系的可靠高效，并且在检测中分离患病对虾体内的细菌时得到两株AHPND致病菌株，经鉴定该菌株为哈维氏弧菌和副溶血弧菌。因此，该方法可用于海洋和水产养殖业中对于AHPND致病菌的快速检测，进一步实现预防和监测水产养殖中的AHPND传播。