乳腺癌是严重危害人类生命健康的常见恶性肿瘤之一,已位居女性肿瘤死亡首位,全球每年约有120余万妇女患乳腺癌,约50万妇女死于乳腺癌。其发病率和死亡率在世界范围内呈较快增长趋势,每年约以0.2～0.3%的速度递增,且发病年龄趋向年轻化；已经证实,年龄、疾病分期、肿瘤大小、淋巴结转移状况和肿瘤微血管密度等临床病理学因素与肿瘤预后密切相关,且早期远处转移和复发是肿瘤致死的主要原因。因此,迫切需要寻找一个敏感、能早期预测乳腺癌复发转移的分子生物学标志物及抑制其复发转移的基因治疗靶点,为临床对乳腺癌的复发和转移的早期预测提供一定的参考依据。近年来,随着免疫学和分子生物学技术的飞速发展,对乳腺癌标志物其意义的研究也不断增加,从大分子蛋白质标志物到肿瘤基因标志物等达几十种之多,如c-er-B-2,ER, PR, uPA,VEGF, BRCA, muc-1,CD44, maspin, mdr1等,其中对c-erbB-2(HER-2)、ER、PR的研究尤为深入,在乳腺癌的预后评价和治疗中应用最多。但c-erbB-2、ER和PR作为乳腺癌特异性诊断及预测指标,其特异性及灵敏性均不够理想。有必要寻找更好的与预后相关的分子标志物,为临床了解乳腺癌生物学行为、指导治疗提供帮助。近年来,Eph家族在肿瘤发生和发展过程中的作用受到越来越多的关注,从而为细胞信号传导在肿瘤中的作用机制的深入研究开辟了一个崭新的领域。Eph(erythropoitin producing hepatocellular carcinoma)受体家族是已知最大的受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK)家族亚家族,至今已有16个成员,Eph受体的配体Ephrin (Eph family receptor interacting proteins)已克隆有9个成员。Eph与其配体Ephrin是细胞排斥和粘附的关键调节因子,又是建立、维持及重塑细胞组织形态的基础。功能分析表明,该家族在包括神经网络形成、神经管和轴旁中胚层的成型(patterning)、细胞迁移和神经轴突导向、血管发生等方面具有重要的功能。Eph受体及其配体也与肿瘤发生有关,最近一些基因缺失及体内外血管形成实验表明,Eph和Ephrin基因在各种肿瘤中不同程度的表达与肿瘤的恶性进展有关,如：侵袭力增强,更易于发生转移,血管化程度更明显等,由此而导致患者预后差。EphA2是Linsberg于1990年从人角化细胞cDNA文库中筛选得到的Eph亚家族成员,是该亚家族成员被发现的具有酪氨酸激酶活性的第一个基因,它在成人上皮细胞中低水平表达,存在于细胞一细胞粘附部位。已证实它在神经元发育、细胞侵袭、黏附调控等方面具有重要作用。与Eph家族其他成员相比,EphA2广泛高表达于不同的肿瘤组织和细胞系,如：乳腺癌、恶性黑色素瘤、前列腺癌和食管癌等。许多证据表明,在肿瘤的血管形成、肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移过程中,EphA2发挥着重要作用。已经证实EphA2的高表达能诱导非转化乳腺上皮细胞在体内和体外的恶性转化并促进其侵袭转移。而应用EphA2蛋白的抗体靶向抑制试验,下调EphA2蛋白表达的同时,也抑制了肿瘤细胞的生长,进而降低肿瘤的恶性程度。EphrinA1是该亚家族第一个被发现的配体,是从肿瘤坏死因子(TNF-a)诱导的人奇静脉内皮细胞中克隆产生。EphrinA 1配体的结合有利于EphA2受体的自身磷酸化。EphrinA1在肿瘤中表达模式的研究刚刚开始,EphA2及EphrinA1共表达于多种肿瘤组织且二者表达明显相关。活化的内生型EphA2与EphrinA1配体相结合,能抑制整合素调节细胞的粘附作用,从而降低细胞粘连,引起高度的组织侵袭性,同时发现EphrinA1配体的密度决定了EphA2介导的整合素调节的细胞粘附作用。这些结果提示EphA2及其配体EphrinA1参与了肿瘤的发生和发展。新的研究报道EphA2的高表达与许多肿瘤的组织学分级、淋巴结转移及患者的预后有关,在肿瘤治疗方面有潜在的预后价值。但EphA2高表达与各种临床病理学特征的关系在不同类型的肿瘤中表现不一,肺癌组织中高水平的EphA2表达提示患者脑转移的风险增高,但前列腺癌组织却显示EphA2高表达与肿瘤转移无关。目前,国内少见有关EphA2和其配体EphrinA1在乳腺癌中的研究报道。乳腺癌的发生、发展与人体内雌激素的增加、孕激素的减少密切相关,性激素的代谢素紊乱促进了某些乳腺癌的生长,但其确切发病机制目前尚不清楚。新近在对乳腺癌细胞中EphA2表达状况的研究中,越来越多的证据表明EphA2与ER之间存在相互影响。但是对于EphA2、EphrinA1及ERα、ERβ、PR在乳腺癌中的联合检测,国内外少见报道。新辅助化疗是对非转移性肿瘤局部治疗之前进行的全身性、系统性细胞毒性药物治疗。目前新辅助化疗已成为局部晚期乳腺癌的标准治疗。国际上关于乳腺癌新辅助化疗的多中心随机临床实验结果显示：新辅助化疗与辅助化疗同样有效。对新辅助化疗敏感的乳腺癌比不敏感者预后好,特别是在局部进展期乳腺癌的应用中已取得良好的效果。新辅助化疗后许多病理学和生物学指标都发生了改变,很多基因表达均发生了改变。寻找出能够预测新辅助化疗疗效并帮助选择内分泌治疗、化疗方案、判断乳腺癌预后的肿瘤分子标记物已经成为目前研究的热点之一,对于EphA2及ER、PR在新辅助化疗前后乳腺癌中的表达的研究,国内外少见报道。我们通过免疫组织化学技术联合检测了EphA2、EphrinA1及ERα、ERβ、PR的蛋白在乳腺癌中的表达及各自与临床病理学因素的关系；采用免疫组织化学技术检测EphA2和ER, PR在新辅助化疗前后的乳腺癌组织中的表达情况；用RT-PCR技术研究了EphA2及其配体EphrinA1各自的mRNA在乳腺癌中的表达及各自与临床病理学因素的关系；应用逆转录病毒载体介导的RNAi技术抑制EphA2在MCF-7细胞中的表达,以期寻找出能帮助选择有效治疗方案及预测乳腺癌预后的有效指标,并探讨EphA2在乳腺癌中的作用机制及预后价值,以期为乳腺癌的基因治疗提供新的思路。本研究分为四章：第一章乳腺癌中EphA2,EphrinA1及ERa, ERβ, PR蛋白的表达及其意义目的研究EphA2,EphrinA1及ERa, ERP, PR等的蛋白在乳腺癌中的表达及其意义。方法1.用免疫组织化学SP法检测130例乳腺癌组织中EphA2, EphrinA1, ERa,ERβ及PR等各自蛋白的表达水平及其与临床病理因素的关系。2.统计学处理：用spss 13.0 for windows统计软件包对所有资料进行统计学处理。采用卡方检验(chi-square),t(studert t)检验,方差分析(ANVOA),相关性检验等。显著性标准为P<0.05。结果1.EphA2,EphrinA1主要位于肿瘤细胞和血管内皮细胞的胞浆中、少量位于炎性细胞的胞浆中,呈棕黄色或棕褐色；ERα、ERβ和PR主要位于细胞核,呈棕黄色或棕褐色,灶性、片状和散在分布,强表达时胞浆也着色。2.130例乳腺癌组织中,EphA2蛋白阳性表达94例,阳性率72.31%；EphrinA1蛋白阳性表达77例,阳性率59.23%；ERα蛋白阳性表达82例,总阳性率63.08%；ERβ蛋白阳性表达69例,总阳性率53.08%；PR蛋白阳性表达76例,总阳性率58.46%。3.EphA2蛋白在乳腺癌的阳性表达率与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小和病理类型均无显著相关(P>0.05)；而与临床分期、淋巴结转移和组织学分级显著相关(P<0.05)。临床分期较晚者、淋巴结转移组、组织学分级较高组EphA2蛋白的阳性率分别显著高于临床分期较早者、无淋巴结转移组、组织学分级较低组EphA2蛋白的阳性率。4.EphrinA1蛋白的阳性表达率与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、病理类型和淋巴结转移无显著相关(P>0.05)；而与临床分期、组织学分级显著相关(P<0.05),临床分期较晚者和组织学分级较高组EphrinA1蛋白的阳性率分别显著高于临床分期较早者和组织学分级较低组EphrinA1蛋白的阳性率。5.ERβ和Pβ蛋白的阳性表达率与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、病理类型、临床分期、淋巴结转移和组织学分级均无显著相关(P>0.05)。6.ERβ蛋白的阳性表达与乳腺癌患者的年龄、肿瘤大小、病理类型、临床分期和淋巴结转移均无显著相关((P>0.05),ERβ蛋白的阳性表达与组织学分级显著相关(P<0.05),组织学分级较低者ERβ蛋白的阳性率显著低于组织学分级较高者的阳性率。7.EphA2和EphrinA1蛋白阳性染色共同定位于大致相同的肿瘤区域和血管内皮细胞,二者在乳腺癌组织中的分布基本一致。经统计学分析,二者在乳腺癌组织中的阳性表达显著相关(P<0.05)。8.EphA2蛋白在乳腺癌中的阳性表达与PR蛋白在乳腺癌中的阳性表达无显著性相关(P>0.05)。EphA2蛋白在乳腺癌中表达的阳性率与ERα蛋白在乳腺癌中的阳性率显著相关(P<0.05),即EphA2蛋白表达的阳性率随着ERα蛋白阳性率的增高呈下降趋势,EphA2蛋白的阳性表达率在乳腺癌ERα蛋白阴性组显著高于ERα蛋白阳性组(P<0.05)。EphA2蛋白在乳腺癌中表达的阳性率与ERβ蛋白在乳腺癌中的阳性率呈显著性相关(P<0.05),即EphA2蛋白表达的阳性率随着ERβ阳性率的增高呈升高趋势。结论1.在乳腺癌组织中检测到EphA2、EphrinA1、ERα、ERβ和PR的蛋白的表达,提示他们可能与乳腺癌的发生发展有关。2.EphA2蛋白在乳腺癌的表达与临床分期、淋巴结转移和组织学分级显著相关,EphrinA1蛋白在乳腺癌的表达与临床分期、组织学分级显著相关,ERβ蛋白在乳腺癌的表达与组织学分级相关,提示其潜在的预后价值并有可能成为乳腺癌预后评估的肿瘤标志物。EphA2蛋白高表达与乳腺癌淋巴结转移有关,提示其可能参与乳腺癌的转移机制。3.EphA2和EphrinA1在乳腺癌中的蛋白表达分布的一致性提示在乳腺癌中,EphrinA1是EphA2受体的主要配体之一,二者可能在乳腺癌细胞信号传导过程中协调发挥作用。EphA2和EphrinA1共同定位于肿瘤细胞和乳腺癌的血管内皮细胞,提示二者可能协同参与了乳腺癌的血管生成,二者有望成为乳腺癌基因治疗的新靶向。4.乳腺癌组织中有较高的ERα蛋白和ERβ蛋白阳性表达,提示乳腺癌是性激素依赖性肿瘤,可根据受体的含量指导临床进行内分泌治疗。5.乳腺癌细胞EphA2与EphrinA1的表达显著相关,提示EphrinA1的表达受EphA2诱导,EphrinA1可以通过自分泌和／或旁分泌环作用于相应的EphA2受体促进癌细胞增殖及血管形成。6.在乳腺癌中,EphA2蛋白的表达与ERα蛋白负相关,和ERβ蛋白正相关相关,提示ERα可能副性调控EphA2的表达,而ERβ可能正性调控EphA2的表达。7.EphA2和EphrinA1的检测可作为乳腺癌预后的评估指标。第二章EphA2、ER、PR在新辅助化疗前后乳腺癌中的表达及意义目的研究乳腺癌中ER、PR和EphA2的表达在新辅助化疗前后的变化及临床意义。方法采用免疫组化SP法检测ER、PR和EphA2在52例新辅助化疗前后的乳腺癌组织中的表达情况。结果ER、PR和EphA2的表达均与疗效相关；新辅助化疗后的乳腺癌组织中EphA2的阳性表达率显著下降(P<0.05);ER、PR的阳性表达率则无明显变化(P>0.05)。结论新辅助化疗能抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,显著降低EphA2的阳性表达,而对ER, PR的表达无显著影响。第三章乳腺癌中EphA2 mRNA和EphrinA1 mRNA的表达及其意义目的研究EphA2 mRNA和EphrinA1 mRNA在乳腺癌中的表达及其意义。方法1.选择40例乳腺癌冰冻标本,分别经免疫组化证实有不同级别的EphA2蛋白表达和EphrinA1蛋白表达,用于RNA提取。2.应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分别检测其中EphA2mRNA和EphrinA1mRNA的表达,比较各自mRNA与其蛋白表达的相关性及与临床病理因素的关系。3.统计学处理：所有数据均经应用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理。应用t检验(t-test);方差分析(One-Way ANVOA);非参数检验(Kruskal-Wallis test法)；显著性标准为P<0.05。结果1.乳腺癌组织中EphA2 mRNA的表达与组织学分级、淋巴结转移及临床分期均显著相关(P<0.05)；与患者发病年龄、肿瘤大小、病理类型均无关(P>0.05).2.乳腺癌组织中EphrinA1 mRNA的表达与组织学分级、淋巴结转移及临床分期均显著相关(P<0.05)；与患者发病年龄、肿瘤大小、病理类型均无关(P>0.05)3.40例EphA2蛋白表达不同的乳腺癌标本均有EphA2mRNA的表达。10例EphA2蛋白表达0级的mRNA水平(0.34±0.14)明显低于30例EphA2蛋白表达1～3级的mRNA(1级：1.33±0.25；2级：1.55±0.11；3级：1.71±0.19：与0级两两比较：P值均<0.05)水平,在22例EphA2蛋白2～3级表达的样本之间,mRNA表达水平无显著性差异(P>0.05).EphA2蛋白表达和mRNA表达水平不完全一致。4.40例EphrinA1蛋白表达不同的乳腺癌标本均有EphrinA1 mRNA的表达。7例蛋白0级表达的mRNA水平(0.41±0.11)明显低于33例蛋白表达1～3级的mRNA(1级：1.37±0.38；2级：1.59±0.28；3级：1.67±0.19；与0级两两比较：P值均<0.05)水平,在21例蛋白1～2级表达的样本之间mRNA表达水平无显著性差异(P>0.05),在24例蛋白2～3级表达的样本之间mRNA表达水平也无显著性差异(P>0.05)。EphrinA1蛋白表达和mRNA表达水平不完全一致。结论1.乳腺癌癌组织中EphA2 mRNA的表达与组织学分级、淋巴结转移及临床分期均显著相关(P=0.000);EphrinA1 mRNA的表达与组织学分级、淋巴结转移及临床分期相关(P=0.000)；提示EphA2 mRNA的阳性表达和EphrinA 1 mRNA的阳性表达均与乳腺癌的恶性行为相关,有可能成为乳腺癌预后的标记物。2. EphA2mRNA、EphrinA1mRNA的阳性表达与各自蛋白质的表达具有一定的相关性,提示乳腺癌组织中二者主要在转录水平调节。3.EphA2 mRNA和EphrinA1 mRNA表达水平分别与各自蛋白表达水平的不完全一致,提示二者在乳腺癌中存在某种转录后翻译水平的调控机制和蛋白质积聚或降解通路障碍。第四章RNAi靶向沉默乳腺癌细胞系MCF-7中EphA2的表达的研究目的探讨逆转录病毒介导的RNAi对乳腺癌细胞系MCF-7中EphA2表达的影响。以期为乳腺癌的基因治疗提供新的思路和手段、方法1.根据人EphA2mRNA基因编码区序列,按照序列设计原则及网上软件,设计并合成两条互补的编码EphA2shRNA的寡核苷酸序列。2.两条互补的编码EphA2shRNA的寡核苷酸链煺火后与线性载体质粒RNAi-READY-pSIREN-RetroQ连接,构建形成重组质粒pSIREN-RetroQ-EphA2,同时用试剂盒提供的阴性对照siRNA双链寡核苷酸构建对照载体pSIREN-RetroQ-C。3.以重组质粒pSIREN-RetroQ-EphA2转化大肠杆菌。用碱裂解法少量制备质粒DNA,然后进行酶切鉴定和DNA测序分析。4.脂质体介导下转染到包装病毒细胞株PA317中,并进行克隆与筛选。5.以重组质粒pSIREN-RetroQ-EphA2转染MCF-7细胞,并用嘌呤霉素筛选稳定表达的克隆。6.Westen-blot检测EphA2蛋白的表达。结果1.重组逆转录病毒载体pSIREN-RetroQ-EphA2经酶切鉴定结果正确；测序分析证实插入的EphA2 siRNA的方向及序列正确。2.Western blot分析,与对照空载体及未转染细胞相比,重组逆转录病毒表达载体pSIREN-RetroQ-EphA2转染的MCF-7细胞中EphA2蛋白表达水平明显降低。结论1.从EphA2 mRNA序列中筛选出有效的siRNA序列,并设计了互补双链寡核苷酸发夹结构,成功构建了EphA2 siRNA的逆转录病毒表达载体,并将之转染到MCF-7细胞。2.通过逆转录病毒载体介导的RNAi,能够抑制MCF-7细胞中EphA2勺蛋白表达,为观察转染siRNA的逆转录病毒表达载体的乳腺癌细胞恶性生物学行为变化奠定了实验基础,为以EphA2为靶向的乳腺癌的基因治疗提供了新的思路和手段。