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目的当结核病至少对两种一线药物异烟肼和利福平同时耐药时,被称为耐多药结核病。结核病耐药性检测在结核病防治过程中具有重大意义。在我国,结核病耐药性检测最主要的手段为药敏试验。传统的药物敏感性试验(DST)从病人就诊到确定其是否患有耐药结核病需要2-3个月,在此期间不仅延误了治疗,而且会使抗性菌株进一步地传播,同时错误的治疗方法还会加剧耐药性结核病的恶化。目前也有一些快速检测结核病耐药性的方法,但是有的准确度不高,有的操作复杂或价格昂贵,难以在发展中国家推广。所以本研究的目的在于:针对我国国情,以液相芯片为基础,开发出一种快速、准确、简单且价格相对较低的检测方法。方法耐药性的产生有其分子生物学基础,大量研究表明基因点突变是导致结核分枝杆菌产生耐药性的根本原因。利福平(RIF)耐药性的产主要是由于在rpoB基因81bp长度的耐药决定区发生突变,而katG和inhA的基因突变则会导致异烟肼(INH)耐药。与耐多药结核病最为相关的突变为:①katG315由AGC突变成ACC或AAC(INH耐药,突变频率为50%-90%);②inhA-15由C突变成T(INH耐药,突变频率为6%-30%);③rpoB531由TCG突变成TTG或TGG,及rpoB526由CAC突变成GAC或TAC(RIF耐药,突变频率分别为75%左右和10%左右)。基于以上理论,本实验使用液相芯片法对上述4个位点的11个野生型/突变型等位基因进行检测,以诊断结核病的耐药性。首先人工合成含有上述3个基因的野生型和突变型序列,使用液相芯片方法检测该已知序列已知位点的突变情况,以验证该方法的可行性及特异性;再以牛型分枝杆菌BCG为模板模拟实际样本的检测;最后使用液相芯片法检测临床结核病样本的耐药性。具体说来,将katG基因和rpoB基因的部分序列拼接成一条420bp的片段,该片段同时含有野生型katG315、rpoB526和rpoB531位点,在保持其它位置序列不变的前提下,将各位点变成其突变形式,并且将3个位点不同的野生/突变型以排列组合的方式合成新的序列,共计8条。以这些片段为模板,经单重PCR、产物纯化,其PCR反应产物与ASPE(等位基因特异性引物延伸反应)引物以不同的组合方式进行反应,检验各位点的基因型以验证实验方法的可行性和特异性。与此同时,本实验也对各关键步骤进行条件优化。此后以BCG为模板,模拟实际情况的样本进行耐药相关位点检测。实验设计了3组引物,经条件优化后,能够在同一体系中进行多重PCR反应,同时扩增出三个片段。经多重PCR反应及上述后续步骤,考查液相芯片法在结核分枝杆菌检测中的应用效果最后,收集153例临床结核病样本,以从中提取的结核杆菌基因组为模板,应用液相芯片法对这些样本进行耐药性检测。同时,对各检测位点进行测序,将测序结果与液相芯片检测结果进行比对。结果实验结果表明,液相芯片法在检测不同位点、相同位点不同基因型、混合感染等情况时具有很高的可行性及特异性。ASPE最佳反应为退火温度59℃,40个循环;杂交反应最佳条件为37℃杂交30min。此后以BCG为模板进行耐药相关位点检测,实验结果证明当以基因组为模板时,液相芯片法依然具有良好的准确性和特异性。最后,153例临床结核病样本检测结果表明,针对耐药相关的3基因4位点的11种野生/突变型检测,液相芯片与测序结果基本相同:在153例样本中,液相芯片检测出有10个位点存在混合感染,其中7个位点测序结果与之相符,3个位点的测序结果仅显示为单基因型结核分枝杆菌的感染;剩余位点均为单独感染,两种方法结果一致。液相芯片法准确度高,特异性强,成本低,可在一个工作日内完成多个样本的检测,并且在混合感染检测情况时具有很大优势。结论液相芯片法在结核病早期诊断和防治过程中具有较高应用价值,适合在发展中国家推广。