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鸡新城疫(Newcasttle Disease，ND)和鸡传染性支气管炎(Infectious Bronchitis，IB)是鸡的主要呼吸道传染病，严重危害养鸡业的发展。基因芯片技术是近年来发展起来的一种生物新技术，该技术可应用于基因表达谱分析、基因位点突变分析和疫病检测等方面。本研究首次构建制备了NDV-IBV基因检测芯片，建立了检测NDV、IBV基因芯片检测新技术，该技术对NDV、IBV的检测具有同步检测和鉴别诊断的功能，是动物疫病病原检测方法新的突破和进步。本研究的主要研究内容包括以下三个方面： 1、NDV-IBV检测基因芯片的靶基因克隆及鉴定研究 对NDV和IBV等病原进行分子生物学特征分析，根据文献和GenBank中报道NDV、IBV、AIV和IBDV的基因序列，用DNA Club2.0或Arraydesigner 2.0软件设计了5对NDV靶基因引物、4对IBV靶基因引物、2对AIV和1对IBDV对照靶引物。试验以NDV Lasota株、NDV F48E9株、IBV M41株、IBV SM株、IBD中等毒力疫苗株和AIV株为材料，用RNA／DNA抽提试剂盒抽提病毒RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板，PCR扩增获得了5个NDV靶基因、3个IBV靶基因、2个AIV基因和1个IBDV基因，分别命名为ND1、ND2、ND3、ND4、ND5、IB1、IB2、IB3、AI1、AI2、IBD1。其中ND1系NDV HN基因片段，长487bp；ND2系NDV NP基因片段，长135bp；ND3、ND4系NDV L基因片段，分别长334bp和540bp；ND5系NDV F基因片段，长522bp；IB1和IB2系IBV NP基因片段，分别长276bp和1010bp；IB3系IBV M基因片段，长315bp；1个末鉴定基因WZ，长为364bp；AI1系AIV M基因片段，长789bp；AI2系AIV NP基因片段，长522bp；IBD1系IBD VP3基因片段，长428bp。同时用pMD18-T Vector载体成功地克隆筛选出T／ND1(F48E9)，T／ND2(Lasota)，T／ND3(Lasota)，T／ND4(F48E9)，T／ND5(Lasota)，T／ND5(F48E9)，T／IBI(SM)，T／IBI(M4 J)，T／IB2 (SM)，T／IB3 (M41)，T／WZ，T／AI1，T／AI2，T／IBD1等14个重组质粒，经BamH Ⅰ酶切、PCR和核酸序列测定鉴定了克隆重组质粒，为NDV-IBV检测基因芯片的构建和制备提供了确实可靠的靶基因材料，是NDV-IBV基因检测芯片构建的关键技术之一。 2、NDV-IBV检测基因芯片构建研究 本试验对基因芯片的制备、探针制备和基因芯片检测方法进行了研究，构建了NDV-IBV检测基因芯片和初步研究了NDV强弱毒鉴别基因芯片。 (1) 基因芯片的制备 以靶基因重组质粒DNA为模板，经PCR扩增、异丙醇沉淀纯化靶基因，同时以λDNA模板和设计引物经PCR扩增制备了长为500bp的定位基因，四川农业大学博士学位论文靶基因和定位基因浓度为161.88一1218.36ng/pl。用基因芯片点样缓冲液将靶基因和定位基因稀释成一定浓度后，基因芯片点样仪SpotArray24点样制备芯片。芯片基片为氨基化基片，点样参数为样点中心间距450 pm，样点直径220协m，点样后室温干燥Zhrs、水合处理105、紫外线交联25mi n.和0.2%SDS洗涤smin.等系列处理，制备了NDV一IBV检测基因芯片。(2)基因芯片探针制备以cDNA为模板，经PCR扩增标记体系中，CY3一dCTP的使用终浓度为:PCR扩增标记荧光素CY34.0 pM，dCTP的终浓度为其他dNTP的终浓度为200.0 pM，制备的探针经试剂盒纯化后浓度为39.ng/pl之间。制备探针。100.0抖M，09一145.76 (3)基因芯片的检测方法及分析试验确定了基因芯片检测技术流程和主要参数。芯片经95一100℃变性1一Zmi n.后用无水乙醇快速冷却，离心干燥，在44℃下预杂交30min一6Omi n.，探针95℃变性smi n.，冰浴急冷后加杂交缓冲液配成杂交液，取25一30 pl用于芯片杂交，在一定温度下杂交时间为7一ghrs。然后用洗液1(2.0%SSc0.1%SDS)、洗液2(0.2%SSC 0.1%SDS)、洗液3(0.16%SSC 0.1%SDS)先后洗涤1次，每次3一smin.洗涤后离心干燥，芯片用ScanArray400o扫描仪扫读，数据用QuantArra声Ver.2.1软件和数据分析软件分析处理。 (4) NDV一IBV检测基因芯片的构建试验研究了不同靶基因的最适杂交温度和靶基因之间的交叉杂交反应以及制备芯片时靶基因的点样浓度，根据不同靶基因的最适杂交温度和交叉杂交反应情况将靶基因分类，成功构建了NDV一IBV检测基因芯片。结果为NDZ、ND3、NDS、IBI、IBZ、IB3、All、AIZ和IBDI在44，C下，NDI、NDZ、ND3、NDS、IBI、IBZ、All、AIZ或NDI、NDZ、 ND3、ND4、NDS、IBI、IB3、All、AIZ、IBDI在48，C下和NDI、ND3、ND4、NDS、IB3、AllZ、IBDI在52oC下杂交效果好，各靶基因之间杂交无交叉反应，靶基因的点样浓度确定为IO0ng/pl。 (5) NDV强弱毒株鉴别检测基因芯片的初步研究。cDNAI、cDNA3为强毒株检测靶基因，cDNAZ为弱毒株检测靶基因，靶基因点样浓度为20Ong/“1，杂交温度为44℃，杂交时间为2.0 hrs一4.ohrs。研究表明制备的检测芯片可对NDV F48E9和NDV Lasota株进行鉴别诊断。3、NDv‘IBy检侧基因芯片的检侧技术研究 试验制备的NDV一IBV检测基因芯片，芯片上有定位基因LG、靶基因NDI、ND3、NDS、IBI、IB3、All、AIZ和IBDI等9种基因，研究T芯片检测的标准化条件、特异性、灵敏性、重复性和结果判断标准。中文摘要 (1)检测探针制备