第一部分：ICOSL在中性粒细胞哮喘患儿中的作用　　目的：　　研究中性粒细胞哮喘患儿外周血及肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中ICOSL（inducible co-stimulator ligand）的表达水平，并分析其与其他细胞因子的相关性，探讨ICOSL在中性粒细胞哮喘中表达的临床意义。　　方法：　　选取于2014年8月～2016年7月在苏州大学附属儿童医院呼吸科住院并符合诊断标准的哮喘患儿32例，同期在苏州大学附属儿童医院行下呼吸道异物取出术的16例患儿作为对照组。所有患儿均采集住院后24小时内的外周血及入院后肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），收集临床资料。32例哮喘患儿中根据BALF中细胞分类情况以NEU≥50%为中性粒细胞哮喘组（NA组）12例，男8例，女4例，其余为非中性粒细胞哮喘组（A组）20例，男16例，女4例。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测外周血及BALF中 ICOSL、IFN-γ、NE、IL-8、MMP9、IL-4的表达水平，分析比较中性粒细胞哮喘组、非中性粒细胞哮喘组及对照组临床特征、ICOSL表达水平与Th1、Th2、Th17型细胞因子的相关性。　　结果：　　NA组和 A组有湿疹史或过敏原点刺、血过敏原阳性检出者均为75%；NA组平均住院天数11.18±4.29天长于A组的平均住院天数7.55±4.45天，差异有统计学意义（P<0.05）；外周血中NA组ICOSL、NE、IL-8、IL-4及MMP9明显高于A组及C组，A组的NE、IL-4浓度也明显高于C组，NA、A组IFN-γ明显低于C组，差异均有统计学意义（P<0.05）；BALF中NA组ICOSL、NE、IL-8及MMP9浓度明显高于A组和C组，A组的MMP9浓度也明显高于C组，A组的NE浓度明显低于C组，NA组、A组 IFN-γ浓度明显低于C组，差异均有统计学意义（P<0.05）。外周血中ICOSL与IL-8水平相关性较好（r=0.683，P=0.042）；BALF中ICOSL与IL-8水平相关性较好（r=0.700，P=0.036）。　　结论：　　中性粒细胞哮喘及非中性粒细胞哮喘患儿体内都存在 Th1/Th2/Th17的免疫失衡，但这种免疫失衡在中性粒细胞哮喘患儿体内表现的更为严重，临床治疗困难，需要住院治疗时间长。中性粒细胞哮喘患儿外周血及BALF中ICOSL表达均较正常组升高，ICOSL可能是通过调节Th17分泌IL-17，增强IL-8作用使中性粒细胞在气道内募集及NE、MMP9明显增加，参与中性粒细胞哮喘免疫炎症的发生发展。　　第二部分：ICOSL抗体干预在中性粒细胞哮喘小鼠模型中作用的研究　　目的：　　研究ICOSL抗体干预在中性粒细胞哮喘小鼠模型中的作用，探讨ICOSL在中性粒细胞哮喘中免疫病理机制及Th1/Th2/Th17失衡中的地位。　　方法：　　将SPF级的6周龄Balb/c小鼠，随机分为四组：正常对照组（CON组）、中性粒细胞哮喘组（NEU组）、ICOSL抗体干预组（ICOSL抗体组）和IgG抗体同型对照组（IgG组）。NEU组、ICOSL抗体组和IgG组均给予OVA+LPS致敏及激发（0、7、14天给OVA+LPS腹腔注射致敏，第22天起连续七天OVA雾化吸入30min激发），CON组给同剂量PBS注射和激发。对ICOSL抗体组和IgG组分别在0、3、7、10、14天腹腔注射ICOSL抗体和IgG同型对照抗体50μg。各组小鼠末次激发24小时内，摘眼球取血约1 mlEDTA抗凝，左肺进行支气管肺泡灌洗，回收1.5 ml左右肺泡灌洗液，取出新鲜右侧肺脏。采用流式细胞仪检测外周血和肺组织中性粒细胞上ICOSL表达，BALF计细胞总数及分类计数，BALF及外周血细胞因子IFN-γ、IL-6、IL-13、IL-17检测，肺组织病理学及组织形态学分析。　　结果：　　CON组小鼠激发后无行为学变化；NEU组小鼠在第一次激发约5分钟后出现行为学变化，第五次激发开始即出现明显的行为学变化；ICOSL抗体组小鼠在第三次激发开始出现行为学变化，第七次激发行为学表现相对不明显；IgG组小鼠整体行为学表现较NEU组稍有改善，较ICOSL组明显。四组小鼠外周血中性粒细胞上均有ICOSL表达，NEU组阳性率最高，ICOSL抗体组最低，各组间两两比较，P<0.001；四组小鼠肺组织中性粒细胞上ICOSL均有表达，NEU组阳性率最高，CON组最低，但四组间两两比较差异均无统计学意(P>0.05)。BALF中总细胞数NEU组最高，CON组最低，差异有统计学意义。BALF中中性粒细胞比例CON组最低，其次ICOSL抗体组，NEU组和IgG组均高，差异有统计学意义（P<0.05）。外周血中，CON组IFN-γ浓度明显高于NEU组、ICOSL抗体组、IgG组，差异有统计学意义（P<0.05）；ICOSL抗体组IL-6浓度最低，NEU组最高，四组组间比较均有统计学差异（P<0.05）；CON组IL-13浓度均明显低于NEU组、ICOSL抗体组、IgG组，差异有统计学意义，（P<0.05）；NEU组IL-17浓度均明显高于CON组、ICOSL抗体组、IgG组，差异有统计学意义（P<0.05）。BALF中，IFN-γ在CON组最高，明显高于NEU、IgG组，差异有统计学意义（P<0.05），CON组与 ICOSL组差异不明显；CON组 IL-6最低，与 NEU、ICOSL、IgG组比较差异有统计学意义（P<0.05）；IL-13在 CON组最低，NEU组最高，两组比较差异有统计学意义，ICOSL抗体组、IgG组较NEU组有降低，差异有统计学意义（P<0.05）；IL-17在NEU组最高，CON组、ICOSL组、IgG组均低于NEU组，差异有统计学意义（P<0.05）。肺组织HE染色后NEU、IgG组气管腔狭窄，支气管粘膜上皮水肿、脱落和变性，气管周围及肺组织、肺泡间隔可见中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞等浸润明显；ICOSL抗体组小鼠气管管腔粘膜上皮增生及气管周围、肺组织、肺泡间隔炎症细胞浸润情况较NEU、IgG组改善；PAS染色肺组织粘液，可见NEU、IgG组粘液分泌明显，ICOSL存在一定程度的粘液分泌但较NEU、IgG组改善。ICOSL免疫组化分析，NEU、IgG组小鼠肺泡间质及气道周围ICOSL阳性表达细胞明显多于ICOSL抗体组，ICOSL阳性表达的细胞四组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。　　结论：　　中性粒细胞哮喘小鼠模型激发前给予ICOSL抗体干预后使哮喘发作行为学改变发生减缓，发作症状减轻，直至对激发耐受；能减轻气道的炎性细胞浸润及粘液分泌；部分降低外周血及BALF中IL-6、IL-13、IL-17水平及升高IFN-γ水平。表明阻断ICOS/ICOSL信号通路可部分阻断中性粒细胞哮喘的发展历程，可望为哮喘的治疗提供新靶位。