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近年来,由于生物活性肽不仅能提供人体生长发育所需的营养物质,且同时具有重要的生理功能而受到广泛关注。作为一种高效快速的蛋白酶解技术,微波辅助蛋白酶解具有作用时间短,酶解速度快,酶解产物可控等特点。但用于蛋白酶酶解制备多肽过程中由于微波的加热效应,容易使得蛋白变性或酶失活。此外,生物活性肽在制备过程中由于自由酶本身自水解难以避免,酶活容易受到酶解环境的影响从而造成酶解效果降低,而固定化酶解具易于从底物中分离出来,避免酶解后灭活给活性多肽带来影响可重复利用等特点,因此结合固定化酶酶解技术,发展一种可提高微波辅助蛋白酶解效率的方法快速高效制备生物活性多肽,对实现活性多肽工业化具有重要意义。 本文结合固定化酶技术,提出了连续微波辅助蛋白酶解方法,设计了相应的装置用于磁性材料固定化酶酶解BSA;同时以广西特色资源食材银杏蛋白和野生黑蚂蚁蛋白为原料,采用连续微波辅助自由酶以及固定化酶酶解方法,研究两种蛋白的酶解效果以及规律,对微波辅助酶解技术进行了研究并对实验条件进行了优化,具体研究内容如下: (1)设计了相应的装置用于连续微波辅助酶解,通过外部的冷却装置使得酶解体系的温度维持稳定的同时保证微波功率的连续性输出,结合固定化胰蛋白酶酶解BSA,研究了连续微波辅助的酶解规律,结果表明微波功率影响蛋白酶解效果,低微波功率可获得丰富的多肽碎片,碎片分子量主要分布在1000-4000 Da,在高功率微波条件下酶解BSA获得的多肽碎片分子量较大。在最优条件下酶解BSA和细胞色素C10 min分别获得46％和80%的多肽序列覆盖率。 (2)连续微波辅助结合磁性粒子固定化菠萝蛋白酶酶解银杏的研究。研究表明,连续微波辅助结合固定化酶技术可快速高效酶解银杏蛋白。获得的ginnacin和legumin两种蛋白氨基酸序列覆盖率均为79%。通过统计酶解获得的多肽的端基氨基酸酶切点发现连续微波辅助蛋白酶解主要作用于亲水性酶切点,此外在500 W连续微波条件下主要酶切点在精氨酸(R)。对比非连续微波以及常规自由酶酶解证明连续微波辅助蛋白酶解获得具有亲水性氨基酸端基的多肽比例明显高于非连续微波以及常规自由酶酶解。说明连续微波辅助酶解技术具有一定的定向酶解作用。 (3)研究了连续微波辅助蛋白酶解法在制备活性多肽中的应用以及活性多肽的LC-MS鉴定。通过研究连续微波辅助胃蛋白酶酶解蚂蚁蛋白产物的生物活性发现蚂蚁蛋白酶解产物具有较强的抗ACE活性。与常见抗血压药马来酸依那普利和赖诺普利的抗A C E效果相比,蚂蚁蛋白酶解物显示出潜在的抗血压功效,半抑制量达47.42路。通过对比不同酶解条件下获得的多肽的峰面积变化规律与抗ACE活性变化规律推测酶解产物中抗A C E活性肽的结构可能为VAIQ、AGDDAPRVF和YALPHAIL等小分子多肽。