第一部分 坐骨神经的不同结扎力度与神经病理性疼痛的关系目的 通过对大鼠坐骨神经结扎力度的量化分级,一方面可以探究易位关联膜蛋白1(TRAM1)能否在一定程度上作为神经病理性疼痛基础研究的生物学指标;另一方面,可探究能否建立不同程度的慢性缩窄性损伤(CCI)模型,并为量化、固定结扎力度建模提供数据支持。方法 1.选取成年雄性大鼠30只,体重200～250g,利用随机数字表法将大鼠分为空白组(Naive组,N组,n=8)、假手术组(Sham组,S组,n=8)和神经结扎组(CCI组,n=14)。所有大鼠术前均进行疼痛行为学筛查,入组后各组随机抽取5只大鼠进行疼痛行为学检测。CCI组采用传统的CCI建模方法(坐骨神经结扎时,在四十倍显微镜下观察坐骨神经外膜的血管只是受压但血流并未中断,偶尔可观察到周围肌肉出现微小抽搐),应用高倍解剖显微镜,生物医学信号采集处理系统和拉力传感器监测建模过程中的结扎力度,建立神经病理性疼痛模型;Sham组除不结扎坐骨神经外,其余操作同CCI组;Naive组不做手术操作。各组大鼠于手术后第1、3、5、7、10、14、21、28天观察姿势步态并测定机械痛阈及热痛阈,对比评估大鼠的行为学和疼痛阈值变化;各组在相同时间点进行取材,观察大鼠坐骨神经外膜血管及神经形态变化,探究传统CCI建模方法下的结扎力度。2.选取成年雄性大鼠102只,体重200～250 g,利用随机数字表法将大鼠分为空白组(Naive组,N组,n=17)、假手术组(Sham组,S组,n=17)、神经结扎组(CCI组,n=68),并按照不同结扎力度将神经结扎组分为四个亚组,分别为:0g(CCI-A 组,n=11)、1g(CCI-B 组,n=11)、2g(CCI-C 组,n=11)和3g(CCI-D组,n=35),所有大鼠术前均进行疼痛行为学筛查,入组后各组随机抽取5只大鼠进行疼痛行为学测定。麻醉后,应用高倍解剖显微镜,生物医学信号采集处理系统和拉力传感器监测建模过程中的结扎力度,建立坐骨神经不同结扎力度的CCI模型;Sham组除不结扎坐骨神经外,其余操作同CCI组;Naive组不做手术操作。各组大鼠于手术后第1、3、5、7、10、14、21、28天观察姿势步态并测定机械痛阈(PWT)和热痛阈(PWL),对比评估大鼠的行为学和疼痛阈值变化;各组在相同时间点进行取材,观察大鼠坐骨神经外膜血管及神经形态变化;利用蛋白免疫印迹(western blot)法检测脊髓(SC)及背根神经节(DRG)中白介素-6(IL-6)、磷酸化核因子κB(p-NF-κB)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)和TRAM1的表达;通过组织免疫荧光分析脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的激活情况。结果 1.应用生物医学信号采集处理系统和拉力传感器,发现传统CCI模型坐骨神经的结扎力度为3 g;2.TRAM1的表达随坐骨神经结扎力度的增加而增加;3.CCI各亚组均诱发大鼠行为学和疼痛阈值的改变,评估认为各亚组均建模成功;大鼠坐骨神经的压缩程度,行为学和疼痛程度的变化,神经外膜血管的扭曲和新生血管的生成程度,脊髓炎症因子IL-6、p-NF-κB、p-ERK和caspase-3的表达,脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的激活情况,均随坐骨神经结扎力度的增加而增加。4.应用生物医学信号采集处理系统和拉力传感器,发现大鼠CCI模型中坐骨神经的结扎力度为3g时,大鼠行为学和疼痛程度,脊髓炎症因子表达以及脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞激活等变化均最为显著。结论 TRAM1的表达与坐骨神经结扎力度呈正相关,一定程度上可以作为神经病理性疼痛基础研究的生物学指标;初步建立了不同程度的CCI模型,有助于对不同程度的神经病理性疼痛进行相关的研究;初步认为大鼠CCI模型中的坐骨神经结扎力度可固定为3 g。第二部分:CCI模型坐骨神经结扎力度的量化研究目的 通过对传统CCI模型进行结扎力度的量化和固定,初步评估固定力度建模模型的稳定性以及TRAM1在传统建模组和固定力度建模组中的表达情况,探讨固定力度建模能否在一定程度上提高CCI模型建模的稳定性,并进一步验证TRAM1能否作为神经病理性疼痛基础研究的生物学指标。方法 选取SPF级成年雄性SD大鼠40只,体重200～250 g,利用随机数字表法将大鼠分为空白组(Naive组,N组,n=10)、假手术组(Sham组,S组,n=10)、传统建模组(CCI组,n=10)和固定力度建模组(CCI-D组,n=10)。所有大鼠术前均进行疼痛行为学筛查,入组后各组随机抽取5只大鼠进行疼痛行为学检测。麻醉后,传统建模组(CCI组)采用传统CCI法(坐骨神经结扎时,在四十倍显微镜下观察坐骨神经外膜的血管只是受压但血流并未中断,偶尔可观察到周围肌肉出现微小抽搐)建立神经病理性疼痛模型,固定力度建模组(CCI-D组)应用高倍解剖显微镜,生物医学信号采集处理系统和拉力传感器将结扎力度固定为3 g行坐骨神经结扎,方法同CCI组;Sham组除不结扎坐骨神经外,其余操作同CCI组;Naive组不做手术操作。各组大鼠于手术后第1、3、5、7、10、14、21、28天观察姿势步态并测定PWT和PWL,对比评估大鼠的行为学和疼痛阈值变化;分别在相同时间点利用western blot、ELISA法检测SC及DGR中IL-6、TRAM-1和p-ERK的表达情况,对比分析传统建模组与固定力度建模组大鼠的疼痛行为学和相关因子表达的稳定性。结果 1.传统CCI建模组与固定力度建模组均诱发神经病理性疼痛,评估认为两组均建模成功,但固定力度建模组大鼠的行为学和疼痛阈值的变化,SC及DGR中IL-6和p-ERK的表达均更为稳定。2.TRAM1在固定力度组中的表达更稳定。结论固定力度建模组大鼠的行为学和疼痛阈值的变化,脊髓及DGR中IL-6和p-ERK的表达均更为稳定,在一定程度上有利于提高传统CCI建模的稳定性。TRAM-1在固定力度组中的表达较稳定,进一步验证了其可以作为神经病理性疼痛基础研究的生物学指标。第三部分 TRAM1与神经病理性疼痛的关系探究目的 通过建立固定结扎力度为3g的CCI模型,研究TRAM1与神经病理性疼痛的相关性及其合成部位,探讨TRAM1参与神经病理性疼痛发生发展的可能机制。方法 选取成年雄性大鼠104只,体重200～250 g,利用随机数字表法将大鼠分为空白组(Naive组,N组,n=11)、假手术组(Sham组,S组,n=11)和实验组(CCI组,n=82)。所有大鼠术前均进行疼痛行为学筛查,入组后各组随机抽取5只大鼠进行疼痛行为学检测。麻醉后,CCI组应用高倍解剖显微镜,生物医学信号采集处理系统和拉力传感器将结扎力度固定为3 g行坐骨神经结扎;Sham组除不结扎坐骨神经外,其余操作同CCI组;Naive组不做手术操作。各组大鼠于手术后第1、3、5、7、10、14、21、28天观察姿势步态并测定PWT和PWL,对比评估大鼠的行为学和疼痛阈值变化;各组在相同时间点进行取材,利用western blot法检测SC及DRG中TRAM1、p-ERK的表达情况;利用免疫荧光染色分析TRAM1的表达和合成部位;在表达高峰对各组大鼠鞘内注射TAK-242(Toll样受体-4抑制剂)、BAY11-7082(IKBa/NF-KB 抑制剂)及 TRAM1-siRNA(TRAM1 小干扰 RNA),观测大鼠疼痛行为学的变化,检测TRAM1及p-NF-κB的表达情况,分析TRAM1与疼痛信号通路分子的相关性,探究TRAM1介导神经病理性痛的可能机制。结果1.CCI大鼠SC和DRG的TRAM1表达增加,在术后第7天出现表达高峰,与疼痛程度呈现正相关;2.TRAM1的合成部位主要位于脊髓背角和DRG的神经元;3.鞘内注射TAK-242、BAY11-7082和TRAM1-siRAN后,大鼠疼痛阈值升高,SC和DRG中TRAM1及p-NF-κB的表达明显降低,与疼痛程度呈负相关。结论 TRAM1与神经病理性疼痛程度具有一定相关性。TRAM1主要由脊髓背角和DRG的神经元合成,可能通过影响TLR4(Toll样受体-4)/p-NF-κB炎症通路介导神经病理性疼痛的发生发展。第四部分 TRAM1在腕管综合征患者中的表达及临床意义目的 研究TRAM1在不同分型的腕管综合征患者血浆中表达情况和盐酸右美托咪定对腕管综合征患者TRAM1表达的影响,探讨TRAM1是否在一定程度上可作为指导神经病理性疼痛疾病临床诊疗的生物学指标。方法 选取临床上腕管综合征患者50例及健康志愿者10例,依据顾玉东的分型方法将该50例经临床和电生理诊断为腕管综合征的患者分为轻、中、重度。A组(轻)10例,B组(中)20例,C组(重)20例,健康患者为N组10例。治疗前分别检测所有患者血浆中IL-6及TRAM1的浓度。对A组患者进行腕部制动和理疗;将B组分为B1组(罗哌卡因)和B2组(罗哌卡因+右美托咪定),将C组分为C1组(罗哌卡因)和C2组(罗哌卡因+右美托咪定),对四组患者进行神经阻滞麻醉后,进行正中神经松解术。分别检测神经阻滞麻醉后6小时、12小时,24小时患者血浆中IL-6及TRAM1的浓度。结果 腕管综合征患者血浆中IL-6及TRAM1的浓度高于健康患者,且腕管综合征患者血浆中IL-6及TRAM1的浓度随着严重程度增加而增高(C组>B组>A组>N组);中重度腕管综合征患者经过神经阻滞麻醉后正中神经松解治疗,疼痛减轻,血浆IL-6及TRAM1的浓度随着时间降低(T6h>T12 h>T24 h),且右美托咪定配伍组患者治疗效果优于单纯罗哌卡因组患者。结论 TRAM1在不同分型的腕管综合征患者血浆中的表达与疼痛程度呈正相关。盐酸右美托咪定可降低腕管综合征患者血浆中TRAM1的表达。因此,TRAM1在一定程度上可作为指导神经病理性疼痛疾病临床诊疗的生物学指标。