顺铂(Cisplatin, CP)是目前临床上广泛应用的抗肿瘤药物之一,其抑癌作用与剂量成正比。但其在正常组织中的毒副作用,包括神经毒性、耳毒性、肾毒性等,尤其是肾毒性,一定程度上限制了顺铂的应用。近年来研究表明,顺铂通过激活肾小管上皮细胞内复杂的信号通路导致肾小管上皮细胞损伤、凋亡以及坏死,其信号通路包括内质网应激和线粒体功能障碍。但目前对顺铂肾毒性确切细胞内信号及其机制尚未完全阐明。内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ER stress, ERS)是指异常的细胞内环境影响内质网腔内蛋白质正常折叠,导致未折叠蛋白、错误折叠蛋白在腔内聚集以及Ca2+平衡紊乱,最终引起内质网功能紊乱。多种肾脏疾病中存在内质网应激,如膜性肾病、先天性肾病综合征、缺血性肾小管损伤等。内质网应激在顺铂肾损伤中的作用亦有报道。如顺铂处理肾小管细胞可诱导内质网伴侣分子葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78, GRP78)表达上调、内质网相关凋亡分子caspase-12活化。Sigma-1受体分子(sigma-1receptor, Sig-1R)是内质网主要的伴侣分子,位于线粒体相关内质网膜(mitochondrion-associated ER membrane, MAM)上。 Sig-1R主要通过稳定MAM上三磷酸肌醇受体(inositol trisphosphate receptor,IP3R),调节内质网与线粒体之间的Ca2+信号转导,保护细胞活性。研究发现,体外培养大鼠皮层神经元细胞,激活Sig-1R能够抑制缺血引起的Ca2+失衡,减轻细胞缺血性损伤。在大鼠肝脏缺血再灌注模型中,特异性配体激活Sig-1R后,可减轻肝脏缺血再灌注损伤。siRNA干扰人晶状体细胞Sig-1R后,caspase-3活性增加。过表达Sig-1R能明显抑制内质网应激,增加细胞活性。因此,我们设想,Sig-1R可通过阻断内质网应激而对肾小管上皮细胞发挥保护作用。线粒体是细胞的“能量工厂”,是合成ATP、电子传递和氧化磷酸化的主要场所。线粒体功能障碍在肾损伤中的作用已得到广泛关注。在多种肾脏疾病模型中,均存在线粒体形态异常,并伴随线粒体DNA突变、线粒体DNA拷贝数下降以及细胞凋亡。业已证明,线粒体功能障碍亦参与顺铂诱导的小管上皮细胞损伤。顺铂诱导肾小管上皮细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生增多、激活促凋亡蛋白如Bax.Bak,最终导致细胞凋亡。内质网与线粒体是细胞内最重要的两个细胞器,它们在功能与结构上都存在密切联系。内质网和线粒体的交联具有调节细胞Ca2+平衡、传递凋亡信号等功能。现认为,线粒体内的Ca2+浓度与线粒体ATP合成、线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore,MPTP)的开放密切相关。Sig-1R通过稳定IP3R参与线粒体Ca2+浓度调节。因此我们进一步推测,Sig-1R通过调节内质网与线粒体之间的Ca2+平衡,阻断肾小管上皮细胞线粒体功能障碍,保护肾小管上皮细胞。第一部分内质网应激和线粒体功能障碍参与顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤目的：探讨内质网应激以及线粒体功能障碍在顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤中的作用及其机制。方法：体外培养小鼠肾小管上皮细胞,复习相关文献并根据前期预实验结果,应用不同剂量的顺铂(0、5、10、20μmol/L)刺激不同时间(0、6、12、24、48h)。采用real-time PCR检测肾小管上皮细胞内质网伴侣分子GRP78、葡萄糖调节蛋白94(glucose regulated protein94,GRP94)、内质网促凋亡分子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)、线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)拷贝数的表达；western blot检测肾小管上皮细胞上皮性钙粘素(epithelial cadherin,E-cadherin)的表达；Annexin V-PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡；荧光探针Fluo-3/AM检测胞浆Ca2+浓度；CCK-8检测细胞活性；荧光探针DCHFDA染料检测细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成；JC-1染色结合流式细胞术检测线粒体膜电位。结果：(1)顺铂可呈剂量及时间依赖性诱导肾小管上皮细胞活性下降、细胞凋亡增加、上皮性钙粘附蛋白E-cadherin表达减少。与对照组相比,顺铂刺激24小时,细胞凋亡开始增加(增加了249.7%),E-cadherin表达开始减少(减少了38.1%)。(2)顺铂呈剂量依赖性诱导肾小管上皮细胞胞浆Ca2+超载,顺铂呈剂量和时间依赖性诱导肾小管上皮细胞内质网伴侣分子GRP78、GRP94、内质网途径凋亡分子CHOP表达增加,顺铂刺激12小时,GRP78、GRP94表达开始升高(分别升高了55.2%和54.2%),顺铂刺激24小时,内质网途径凋亡分子CHOP表达开始增加(增加了118.7%),提示内质网应激发生时间早于肾小管上皮细膪损伤的发生时间。(3)顺铂呈剂量诱导肾小管上皮细胞ROS产生增加,顺铂呈剂量及时间依赖性诱导肾小管上皮细胞线粒体膜电位下降mtDNA拷贝数下降,顺铂刺激12小时,线粒体膜电位下降、mtDNA拷贝数开始下降(分别下降了33.0%和29.9%),提示线粒体功能障碍发生时间早于肾小管上皮细胞损伤的发生时间。结论：内质网应激和线粒体功能障碍是顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤的早期事件,内质网应激和线粒体功能障碍参与顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤。第二部分Sig-1R通过部分阻断内质网应激减轻顺铂诱导肾小管上皮细胞损伤目的：观察内质网伴侣分子Sig-1R对顺铂诱导肾小管上皮细胞损伤和内质网应激的保护作用。方法：体外培养小鼠肾小管上皮细胞,瞬时转染pcDNA3.0-Sig-1R或Sig-1RsiRNA质粒载体,再分别加入Cisplatin (10μmol/L)或生理盐水(Saline)刺激24h。Sig-1R过表达分组如下：Saline组、Cisplatin组、Saline+Sig-1R过表达、Cisplatin+Sig-1R过表达；Sig-1R干扰分组如下：Saline组、Cisplatin组、Saline+Sig-1R干扰组、Cisplatin+Sig-1R干扰组。应用real-time PCR法检测肾小管上皮细胞内质网伴侣分子GRP78、GRP94.内质网促凋亡分子CHOP的表达；western blot法检测肾小管上皮细胞E-cadherin、内质网伴侣分子GRP78、GRP94、 Sig-1R、内质网凋亡分子CHOP、caspase-12的蛋白表达；Annexin V-PI双染流式细胞仪和Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况；荧光探针Fluo-3/AM检测胞浆Ca2+浓度；CCK-8检测细胞活性；caspase-3的底物检测其活性。体内实验通过制备Sig-1R过表达转基因小鼠,随机分为4组：WT Saline组、WT Cisplatin组、Sig-1R transgenic Saline组、Sig-1R transgenic Cisplatin组。腹腔注射Cisplatin (20mg/kg)构建顺铂急性肾损伤小鼠模型,同时对照组腹腔注射Saline。于腹腔注射后72h处死小鼠,检测尿蛋白/肌酐、血肌酐、血尿素氮水平；HE和PAS染色观察肾组织病理形态学改变；检测肾小管上皮细胞损伤及内质网应激的相关指标。结果：(1)肾小管上皮细胞体外瞬时转染Sig-1R siRNA后,其Sig-1R mRNA和蛋白的表达显著下降。(2)Sig-1R siRNA转染肾小管上皮细胞后再加入Cisplatin刺激,较未转染Sig-1R siRNA的Cisplatin组,细胞活性下降35.2%(P<0.05),细胞凋亡增加80.4%(P<0.05)、caspase-3活化增加,E-cadherin表达减少,胞浆Ca2+浓度升高,(GRP78、GRP94、CHOP表达增加,caspase-12活化增加。(3)肾小管上皮细胞体外瞬时转染pcDNA3.0-Sig-1R过表达Sig-1R, Real-time PCR和western blot结果显示：肾小管上皮细胞Sig-1R mlRNA和蛋白的表达明显升高。(4)与Cisplatin组相比较,过表达Sig-1R可部分阻断Cisplatin诱导的肾小管上皮细胞损伤,过表达Sig-1R可部分阻断Cisplatin诱导的细胞活性降低、细胞凋亡增加、E-cadherin表达下调、caspase-3活化增加。同时,Sig-1R过表达可部分逆转Cisplatin诱导的肾小管上皮细胞胞浆Ca2+超载、GRP78、GRP94、CHOP表达上调、caspase-12活化增加。(5)体内实验结果显示,Sig-1R transgenic Cisplatin组小鼠较WT Cisplatin组,小鼠尿蛋白/肌、血肌酐和血尿素氮浓度分别降低67.7%、51.7%和75.4%(均P<0.05)、NGAL、IL-18表达分别下降65.9%和37.4%(均P<0.05)、细胞凋亡减少、CHOP表达下降、caspase-12活化减少,提示小鼠过表达Sig-1R可部分阻断Cisplatin诱导的急性肾损伤和肾组织内质网应激。结论：Sig-1R通过部分阻断内质网应激减轻顺铂诱导肾小管上皮细胞损伤。第三部分Sig-1R通过部分阻断线粒体功能障碍减轻顺铂诱导肾小管上皮细胞损伤目的：观察内质网伴侣分子Sig-1R对顺铂(Cisplatin)诱导肾小管上皮细胞线粒体功能障碍的保护作用及其机制。方法：体外培养小鼠肾小管上皮细胞,瞬时转染pcDNA3.0-Sig-1R或Sig-1R siRNA质粒载体,再分别力入Cisplatin (10μmol/L)或生理盐水(Saline)刺激24h。Sig-1R过表达分组如下：Saline组、Cisplatin组、Saline+Sig-1R过表达、Cisplatin+Sig-1R过表达；Sig-1R干扰分组如下：Saline组、Cisplatin组、Saline+Sig-1R干扰组、Cisplatin+Sig-1R干扰组。应用real-time PCR和、western blot法检测肾小管上皮细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子α(peroxisome proliferator-activated receptor-y coactivator-la, PGC-la)和线粒体转录因子(mitochondrial transcription factor A, TFAM)的表达；荧光探针钙黄绿素/AM检测细胞MPTP孔开放情况；real-time PCR法检测肾小管上皮细胞mtDNA拷贝数；荧光探针DCHFDA染料检测细胞内ROS生成情况；JC-1染色结合流式细胞术检测线粒体膜电位。体内实验通过制备Sig-1R过表达转基因小鼠,随机分为4组：WT Saline组、WT Cisplatin组、Sig-1R transgenic Saline组、Sig-1Rtransgenic Cisplain组。腹腔注射Cisplatin (20mg/kg)构建顺铂急性肾损伤小鼠模型,同时对照组腹腔注射Saline。于腹腔注射后72h处死小鼠,检测线粒体功能障碍的相关指标。结果：(1)与Cisplatin组相比,Cisplatin+Sig-1R干扰组TFAM、PGC-1α表达分别下降49.7%和42.3%(均P<0.05), ROS产生增加27.9%(P<0.05), mtDNA拷贝数及线粒体膜电位分别下降17.5%和29.3%(均P<0.05), MPTP孔开放增加。(2)过表达Sig-1R可部分阻断Cisplatin诱导的肾小管上皮细胞线粒体功能障碍,过表达Sig-1R可部分阻断Cisplatin诱导的TFAM、PGC-1α表达下降、mtDNA拷贝数及线粒体膜电位下降、ROS产生增加、MPTP孔开放。(3)体内实验结果显示,过表达Sig-1R可部分阻断Cisplatin诱导的TFAM、PGC-1α表达下降、ntDNA拷贝数下降,提示Sig-1R过表达可部分抑制Cisplatin诱导的肾皮质线粒体功能障碍。结论：Sig-1R通过抑制线粒体通透性转换孔开放,部分阻断线粒体功能障碍,从而减轻顺铂诱导肾小管上皮细胞损伤。