hRad9/chk1通路在DNA损伤修复和基因组稳定维护中具有重要作用。人类多种肿瘤细胞中存在hRad9蛋白的高水平表达,并且与肿瘤发生、进展密切相关,但在乳腺癌化疗反应性中作用的研究未见报道。本研究主要探讨hRad9在乳腺癌化疗反应中的作用以及以其为靶点提高化疗敏感性的可行性。第一部分hRad9在乳腺癌化疗反应中的作用研究方法1.挑选山东大学齐鲁医院术前接受至少4周期新辅助化疗乳腺浸润性导管癌标本50例,收集NAC前活检和和NAC后肿瘤组织,完善各项临床病理学资料。2.复习NAC前后肿瘤标本H&E切片,根据Miller-Payne病理反应性分级(MP分级)对所有乳腺癌进行化疗反应性的病理学评价。根据评价结果,将NAC后标本分为化疗敏感组(MP3-5级)和化疗耐药组(MP1-2级)。3.免疫组化检测NAC前后肿瘤组织hRad9、chk1 及 cyclin D1蛋白表达情况。结果1.乳腺癌NAC前活检标本中,hRad9、chk1和cyclin D1蛋白阳性表达率分别为70%、42%和50%。2.通过分析NAC术后标本中hRad9表达与乳腺癌化疗反应的关系我们发现hRad9蛋白表达与乳腺癌化疗反应性差相关(X2=40.9,P=0.000)。3.通过分析NAC术后标本中chkl蛋白表达与乳腺癌化疗反应性的关系我们发现chkl蛋白表达与乳腺癌化疗反应性差相关(X2=5.4,P=0.021)。4.通过双变量分析,我们发现hRad9蛋白分别与chk1、cyclin D1蛋白表达正相关(R=0.327, P=0.020; R=0.393, P=0.005)。5.通过比较NAC前后肿瘤组织hRad9和chkl蛋白表达变化,我们发现化疗后chkl蛋白表达较化疗前明显增高(P=0.012),化疗前后hRad9蛋白表达无明显变化(P=0.571)。结论1.乳腺癌中存在hRad9、chk1高表达,两者的高表达与化疗反应性差密切相关。2.hRad9与chkl表达正相关,提示hRad9/chk1通路可能在乳腺癌化疗抵抗中发挥重要的作用。3.chk1蛋白表达在化疗前后发生显著性变化,提示其可能在获得性化疗耐药中发挥作用；而hRad9蛋白表达在化疗前后变化不明显,提示其过表达与内在性性化疗耐药相关。第二部分以hRad9为靶点提高乳腺癌化疗敏感性的研究方法1.设计并合成靶向干扰hRad9基因表达的小干扰RNA (hRad9-siRNA),以非靶向性干扰序列作为阴性对照(NC-siRNA)。2.将乳腺癌细胞分成三组：hRad9-siRNA转染组、NC组和空白对照组,并将上述siRNA转染乳腺癌细胞系MCF-7 和 MDA-MB-231。3. RT-qPCR检测各组细胞中hRad9 mRNA的表达情况；细胞免疫化学及Western-blot检测各组细胞中hRad9蛋白的表达情况。4.RT-qPCR、Western-blot检测各组细胞中chk1 mRNA及蛋白表达。5.MTS检测hRad9-siRNA转染组和各对照组乳腺癌细胞对化疗药物阿霉素的敏感性变化。6.流式细胞术检测hRad9-siRNA转染组和各对照组乳腺癌细胞加药前后凋亡情况变化。结果1. RT-qPCR、细胞爬片免疫组化及Westernblot结果表明：与对照组(NC组及空白对照组)相比hRad9-siRNA转染组hRad9 mRNA及蛋白的表达均明显降低。2. RT-qPCR 及 Western blot结果表明：沉默hRad9基因表达后,chk1 mRNA及蛋白表达也随之明显降低。3.加药MTS检测结果表明：沉默乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞中hRad9基因表达后能显著增强阿霉素的细胞毒性作用。4.细胞凋亡实验结果表明：无论是否经阿霉素处理hRad9-siRNA转染组细胞凋亡率比对照组明显增加。结论1.hRad9基因沉默后,可显著提高乳腺癌细胞对阿霉素的化疗敏感性及细胞凋亡率,提示hRad9可能成为新的提高肿瘤化疗反应性的靶点。2.hRad9通过调控下游因子chk1蛋白表达发挥提高化疗反应性的作用,hRad9/chkl通路在化疗耐药中的作用机制需要进一步的深入研究。