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目的低密度脂蛋白受体(LDLR)基因突变可导致家族性高胆固醇血症(FH)。修饰的单链脱氧寡核苷酸(MSO)可在基因组的任意位点纠正突变的碱基。本文旨在用反义MSO(A-MSO)对小鼠在体肝细胞中的点突变的LDLR基因进行原位修复研究。方法1 HepG2细胞LDLR基因无义突变模型原位修复1.1构建并鉴定LDLR-虫萤光素酶融合蛋白(LDLR-luc)表达载体将野生型(WT)或660突变型(无义突变)LDLR基因连接到虫萤光素酶基因(luc)5’端,构建pWT-LDLR-luc和p660-LDLR-luc。因660-LDLR基因上存在一个C到A的点突变,导致一个无义突变和HinfI酶切位点。DNA测序鉴定质粒。1.2制备和鉴定HepG2细胞LDLR基因无义突变模型将p660-LDLR-luc瞬时转染HepG2细胞,检测转染后48h HepG2细胞裂解液的虫萤光素酶活性(FLA)以鉴定无义突变模型。1.3 MSO原位修复HepG2细胞LDLR基因无义突变反义MSO(A-MSO)或正义MSO(S-MSO)可序列特异地置换碱基导致突变修复。A-MSO或S-MSO与p660-LDLR-luc共转染HepG2细胞,转染后72h检测HepG2细胞裂解液的FLA以验证无义突变能否修复,并筛选出较佳的MSO链。2小鼠在体肝细胞LDLR基因无义突变模型原位修复2.1验证水动力法的肝靶向性小鼠用水动力法转染pwT-LDLR-luc,检测肝、心、肺、肾和脾组织裂解液的虫萤光素酶活性(FLA),以验证水动力法的肝靶向性。2.2制备和鉴定小鼠在体肝细胞LDLR基因无义突变模型小鼠用水动力法转染p660-LDLR-luc,检测肝FLA和PCR结合限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析以鉴定小鼠在体肝细胞LDLR基因无义突变模型。2.3 MSO肝靶向原位修复小鼠在体肝细胞LDLR基因无义突变小鼠水动力法转染p660-LDLR-luc后12h,以多聚乙烯亚胺(PEI)为载体结合水动力法把MSO输送到小鼠肝脏。给A-MSO 60h后,检测小鼠肝组织裂解液的FLA,以判断无义突变是否修复。2.4 DNA水平验证无义突变修复PCR-RFLP和DNA测序以验证LDLR基因无义突变是否修复。结果1 HepG2细胞实验1.1 WT-LDLR和660-LDLR的DNA测序结果p660-LDLR-luc在LDLR基因上存在一个C到A的突变(TGA),pWT-LDLR-luc则否。1.2虫萤光素酶在HepG2细胞中的表达比较转染不同质粒的HepG2细胞裂解液的FLA。结果显示p660-LDLR-luc组比pWT-LDLR-luc低,但比对照组(转染pWT-LDLR-EGFP)高,差异显著(p＜0.01)。这表明无义突变可能未完全终止虫萤光素酶的表达。1.3 A-MSO和S-MSO在HepG2细胞中增强p660-LDLR-luc表达虫萤光素酶比较用p660-LDLR-luc和各种MSO共转染的HepG2细胞的FLA,结果显示A-MSO和S-MSO均可明显增强p660-LDLR-luc表达虫萤光素酶,且A-MSO较S-MSO强,差异显著(p＜0.01)。2小鼠实验2.1目的质粒靶向小鼠肝脏小鼠水动力法转染pWT-LDLR-luc后72h,检测小鼠肝、心、肺、肾和脾组织裂解液的FLA。结果显示小鼠肝组织FLA较高,而肝外组织几乎检测不到FLA。这表明水动力法转染导致了目的质粒的肝特异性转染。2.2虫萤光素酶在小鼠肝细胞中的表达及PCR-RFLP结果比较分别转染不同质粒的小鼠在体肝组织裂解液的FLA。结果显示p660-LDLR-luc组比pWT-LDLR-luc组低,但比对照组(转染pEGFP-N1)高,差异显著(p＜0.01)。这表明无义突变在小鼠肝脏可能未完全终止虫萤光素酶的表达。PCR-RFLP分析表明小鼠肝细胞中LDLR基因无义突变未被自动修复。2.3 A-MSO在小鼠肝细胞中增强p660-LDLR-luc表达虫萤光素酶比较A-MSO组和C-MSO(对照MSO)组的FLA,结果表明A-MSO组的FLA明显高于C-MSO组的FLA(p＜0.01)。2.4突变碱基A被置换成碱基CPCR-RFLP分析和DNA测序进一步表明LDLR基因上的碱基A被置换成C。结论小鼠水动力法转染p660-LDLR-luc可用于制备小鼠在体肝细胞LDLR基因点突变模型。PEI结合水动力法可使A-MSO有效靶向肝脏。A-MSO可肝内原位修复点突变的LDLR基因。