血管生成是一个复杂的过程，包括内皮细胞活化、增殖和移行、血管基底膜解离以 及新血管形成和血管网的连接等。肿瘤生长与新血管形成有着密切的关系，其表现之一 就是肿瘤依赖局部血管增生，以供应肿瘤生长、发展和转移的需要。抗血管生成的治疗 可以从根本上抑制肿瘤的发展和转移，但临床要求这种治疗一方面必须是持久的：另一 方面必须仅在局部形成高浓度，并且是可调节的。目前只有基因治疗能够符合这些条件。 本研究从这一点出发，瞄准肿瘤基因治疗的前沿，利用核糖体毒素家族中的白喉毒素基 因作为弹头，以VEGF作为导向分子，构建DT390-VBGF融合基因，辅以四环素调控系统， 开展靶向具有丰富的VEGP受体的肿瘤组织及其血管内皮细胞的基因治疗工作。我们在 取得了较为明确的细胞毒性实验和CAM血管抑制实验结果的基础上，比较了裸露的质粒 DNA直接注射瘤体和粗制重组腺病毒感染治疗胃癌的效果，明确了重组腺病毒具有切实 可行的提高目的基因传递效率的实用价值。本研究所取得的成绩为这一领域的发展积累 了很好的资料，而且所构建的载体结构清楚，主要组件装卸方便，为今后更改启动子， 如CEA启动子开展组织特异性基因治疗奠定了很好的基础。 肿瘤血管生成机制的研究以及抗血管生成剂的研制已成为近年来肿瘤基因治疗和 肿瘤研究领域的热点之一。在众多研究中，VEGF己被认为与肿瘤的浸润转移有关，抑制 VEGF的活性或减少其受体KDR均能明显抑制实验性肿瘤的生长和转移的发生。 由于成熟组织的血管内皮细胞憎殖极其缓谩且几乎没有新生血管的形成(妇女孕 期、月经期及创伤修复除外),使得以新生血管作为靶向部位对肿瘤进行基因治疗成为 极其诱人的研究领域。与成熟组织血管的静止状态相比，增生血管有其特异的表达产物 和表达方式，如 ανβ3整合素，癌胚粘连蛋白(oncofetal fibronectin)及内皮细胞 VEGF受体(flt-1和KDR)的高表达等，为肿瘤导向或特异治疗提供了极好的靶位。此 外，与肿瘤细胞的基因组不稳定、易于突变而产生耐药以及抗原表达的异质性相比，血 管内皮细胞具有基因组稳定、不易突变、不易产生耐药、细胞均质以及所处部位药物易 于到达等特点，这些独到之处使得以抑制血管增生的肿瘤生物治疗策略更具吸引力。大 量的临床资料显示，许多肿瘤细胞均可表达VEGF和其受体flt-1、KDR，而且，其表达 水平同肿瘤细胞的恶性生物学行为呈显著正相关。分子生物学的研究结果也表明，许多 生长因子如PDGF，EGF，癌基因产物如Ras，Raf，Src及蛋白激酶如PKC等均可促进VEGF 第二军医大学博士学位论文 中文扬要 的表达，而抑癌基因P53对VEGP的表达具有下调作用，提示癌基因活化或抑癌基因失 活除直接引起肿瘤细胞增殖外，主要可能通过增加VEGF的分泌而促进内皮细胞的增殖 及新生血管的形成，进而加速肿瘤的生长与转移。鉴于此，VEGF成为近年来抗肿瘤基因 治疗研究的一个“热”靶点。 肿瘤由肿瘤细胞本身和含血管的支持连接间质两部分组成。肿瘤生长时，一方面肿 瘤细胞本身不断增殖，另一方面肿瘤血管也必须同时形成以提供肿瘤的养分和排除代谢 废物。如果没有新生血管的形成，肿瘤可长期处于直径仅为1～Zlllin的微小状态。因此， 无论是干扰肿瘤细胞的增殖或者抑制血管的生成，从理论上讲均可对肿瘤的生长和转移 产生抑制作用。 现已证明白喉毒素是由535个氨基酸残基组成的可分泌性蛋白，Mr58，342，其中DTA 片段＊＊93残基）可使真核细胞中EF七因子上的ADP核糖化而失活EF七，造成细胞 内蛋白质合成受阻，最终导致细胞死亡；DTB片段＊94巧35残基）与细胞表面结合将 DTA片段转位至胞浆，其中390635 M基酸残基组成DT的受体结合结构域，该区域可 设计用细胞因子取代而靶向目的细胞。 我们通过PCR从PET15bDT、PBV220－VEGF质粒中扩增了DT删、VEGF；。、VEGP．皿，基 因片段，构建了pcDNA3．1卜卜DT。WEGF；。。，p叨NA3．1卜卜DT。个EGPex似真核表达载体。 在胃癌细胞SGC7901及o45细胞中表达了具有细胞毒性作用的融合分子，即在12孔 板中，在脂质体的介导下 10 u g的重组毒素质粒经 96h可杀死 she的胃癌细胞。说明 DT删 这一原核基因在真核细胞内翻译后加工过程并不影响叮。功能表位的形成，而且融合上 去的 VEGF；知 VEGF。m，也没有于扰 DT。的细胞毒性作用。鸡胚绒毛尿羹膜实验表明 DT。叮EGF；es可以抑制并损伤鸡胚