食管癌是世界范围内发病和死亡综合排名第八位的常见恶性肿瘤。中国又是食管癌的重灾区,占据世界总发病人数的一半。大样本回顾性研究显示,该疾病的预后同疾病的分期和治疗手段的应用关系密切,但由于确诊手段繁琐,加之国人对自身健康状况关注度较低,使得疾病在确诊时就已经处于中晚期,患者总体预后较差,五年生存率长期徘徊在低位,严重威胁着人民群众的健康,是国家大健康战略背景下一个极不和谐的音符。目前食管癌常规治疗手段的选择极为有限,无外乎手术治疗、放射治疗和化学药物治疗三种,并且这三种治疗方法还存在着先天的不足,例如,根治性手术治疗需要患者处于食管癌的早中期阶段且身体能够耐受手术打击。放射治疗可能产生气管食管瘘和放射性肺损伤等严重并发症并且射线本身的诱瘤作用也是患者长期生存的巨大威胁。化学药物治疗的毒副反应明显,很多患者在没有完成疗程之前,就已经无法耐受,被迫放弃化疗。为扭转食管癌治疗方面的不利态势,党和政府每年投入巨资,支持和鼓励一线临床和科研工作者,在实施大范围人群食管癌筛查和常规治疗手段改良的同时,积极探索新的有效的疾病干预措施,并取得了丰硕的研究成果。在众多的研究成果中,抗肿瘤免疫治疗因其副作用小并且接近于人体的自然免疫状态而备受学界关注,尤其是诸如白细胞介素等具有抗肿瘤免疫功能的生物大分子更是近些年来学者们研究的重点。本次研究即选择了具有抗肿瘤和促肿瘤双重作用的促炎症因子、白介素-1超家族重要成员--白介素-18作为研究对象,以白介素-18-KO和白介素-18-WT食管癌荷瘤小鼠为研究工具,探究白介素-18作为一个抗肿瘤炎症因子在实验动物活体内食管癌发生发展过程中的免疫调节作用,并阐明其内在的分子机制,为白介素-18的抗肿瘤临床应用提供实验室依据。第一部分白介素-18的缺乏促进了4NQO诱导基因敲除鼠食管癌的发生和进展目的:探索4NQO饮水法诱导实验小鼠发生食管癌的稳定造模方法,观察白介素-18的缺失对4NQO诱导小鼠食管癌发生的影响及小鼠生存状态的影响。方法:使用PCR法验证白介素-18-KO小鼠的白介素-18基因相比于白介素-18-WT小鼠已经基本敲除。使用4NQO饮水法,诱导小鼠食管癌发生。在预实验中,我们发现在使用4NQO饮水法造小鼠食管癌模型时饮用4NQO溶液的小鼠在第24周时成瘤率已经接近100%,并且最先成瘤的实验小鼠生存状态极差,所以在正式实验部分选择造模实验的第22周统一处死动物,取材做后续实验。无菌环境下,解剖小鼠,取其食管组织、脾脏和外周血。使用石蜡包埋食管组织后做超薄切片行HE染色,经病理学诊断后确认造模成瘤状况。在造模实验期间,定期检查所有实验小鼠的体重、毒性反应、疾病状态和任何异常情况,并详细记录。结果:1.经PCR实验确认,与白介素-18-WT小鼠相比,白介素-18-KO小鼠体内IL-18基因链丢失,白介素-18-KO小鼠已经丧失IL-18活性。2.在造模实验开始后的第五周开始记录体重。体重记录开始的前五周,四组小鼠体重增长速度基本一致。而第十周是变化的分界点,使用诱癌剂的两组小鼠体重开始持续下降,白介素-18-KO组小鼠体重下降速度更快,实验第22周,该组小鼠身体状态极差几近衰竭。3.大体病理结果:空白对照溶液喂养的两组小鼠,食管组织未发生病变。使用诱癌剂的两组小鼠食管变粗,部分野生型小鼠食管粘膜内生有赘生物,无明显坏死出血,边界较清晰;白介素-18-KO小鼠食管明显变粗,几乎所有食管粘膜都出现赘生物,绝大多数病变部位坏死出血,且边界不清。镜下病理结果:癌变细胞团中部分细胞角化,形成角化珠。癌变细胞与正常的组织细胞在形态学方面差异显著,其具体表现为,胞体增大,形状及排列不规则,核分裂相增多,且核浆比失调。4.在第22周结束造模实验时,使用诱癌剂的白介素-18-WT组造模成功率为40%,使用诱癌剂的白介素-18-KO组造模成功率为86.7%,两组间统计学差异明显。结论:1.白介素-18的缺失对于正常喂养的小鼠生存状态影响不明显。2.白介素-18的缺失使得小鼠更容易在诱癌剂的作用下发生食管癌。3.白介素-18的缺失对于诱癌剂作用后处于恶性肿瘤疾病状态下的小鼠机体影响巨大,且存在一个诱癌剂在机体蓄积量和与机体作用时间的临界时间点。第二部分白介素-18的缺失抑制了机体的抗肿瘤免疫能力目的:进一步探索在活体食管癌实验动物模型体内白介素-18的缺失促进食管癌发生发展的细胞免疫学机制。方法:无菌解剖小鼠,取出食管癌组织经病理确认后制备单细胞悬液。取出荷瘤小鼠脾脏组织制备单细胞悬液,使用淋巴细胞分离液密度梯度离心和尼龙毛柱法初步分离小鼠脾脏中的淋巴细胞。取制备好的细胞悬液,以说明书建议的抗体与细胞的比例,标记CD4-PE、CD8-APC和CD69-FITC后将待测样本放置于37℃和5%二氧化碳的细胞培养箱中,避光孵育4个小时,上流式细胞仪检测。取初步分离的淋巴细胞悬液加入适量1-甲氧基-2丙基乙酸酯(PMA)、离子霉素和布蕾菲德菌素(BFA),然后37℃和5%二氧化碳环境下,避光共同孵育4个小时。以适当比例标记CD8-APC、CD3-FITC和NK1.1-PE在4℃环境温度下避光染色30分钟,之后4%多聚甲醛固定细胞,1%皂素进行细胞膜透化处理。使用IFN-γ-PerCPCy5.5抗体进行胞内染色,流式细胞仪检测。取小鼠抗凝外周血,使用炎症细胞因子流式细胞小球微阵列术检测荷瘤小鼠外周血血清中白介素-4、白介素-6、IFN-γ和肿瘤坏死因子(TNF)的含量。结果:1.白介素-18基因敲除的荷瘤小鼠体内激活态的CD8~+T细胞或CD4~+T细胞数量显著减少。2.白介素-18缺陷的荷瘤小鼠脾脏和食管组织中NK细胞和CD8~+T细胞内IFN-γ抗体胞内染色的荧光强度相对于野生型荷瘤小鼠显著降低。3.两组荷瘤小鼠血清中肿瘤坏死因子和IFN-γ的变化趋势与组织中IFN-γ的组间变化趋势相似,且差异存在统计学意义。结论:1.白介素-18的缺失抑制了食管癌组织中T淋巴细胞的活性。2.白介素-18的缺失抑制CD8+T细胞和NK细胞产生IFN-γ。3.白介素-18的缺失降低了荷瘤小鼠外周血血清内肿瘤坏死因子和IFN-γ的含量。第三部分体外实验验证白介素-18的缺失影响了抗肿瘤免疫细胞的增值和凋亡并抑制了其细胞毒性作用目的:观察白介素-18的缺失对抗肿瘤免疫细胞在体外环境下杀伤食管癌标准细胞株能力的影响,并验证与体内实验结果的一致性。方法:取初步分离的荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞,使用美天旎分选试剂盒纯化CD8~+T淋巴细胞和NK细胞。使用细胞质乳酸脱氢酶检测试剂盒,检测效靶比分别为1:1、3:1和10:1时效应细胞(CD8~+T淋巴细胞和NK细胞)对靶细胞(TE-8)的杀伤效果。使用Annexin-V/PI凋亡检测试剂盒在室温下避光染色15分钟,使用流式细胞仪检测并用相应软件计算死亡细胞占比。取纯化后的荷瘤小鼠脾脏CD8~+T淋巴细胞,使用CCK-8检测试剂盒,检测白介素-18-KO组和白介素-18-WT组CD8~+T淋巴细胞增殖状况,并作统计学比较。结果:1.白介素-18的缺失显著降低了荷瘤小鼠脾脏CD8~+T细胞和NK细胞的细胞毒性作用,且结果有统计学差异。2.与野生型食管癌荷瘤小鼠脾脏来源的CTL细胞相比,在同样的常规细胞培养条件下,源于白介素-18基因敲除食管癌荷瘤小鼠的CTL细胞表现出强烈的细胞凋亡现象。3.CCK-8试剂盒测定的72小时细胞增殖结果显示,在同样的常规细胞培养条件下,源于白介素-18基因敲除食管癌荷瘤小鼠的CTL细胞的增殖数量要比野生型食管癌荷瘤小鼠脾脏来源的CTL细胞的增殖数量低的多。结论:1.白介素-18的缺失显著抑制了食管癌荷瘤小鼠抗肿瘤免疫效应细胞--CD8~+T细胞和NK细胞针对靶细胞的直接细胞毒性作用。2.白介素-18的缺失是诱导食管癌荷瘤小鼠细胞毒性淋巴细胞凋亡的明确信号。3.白介素-18的缺失能够显著抑制食管癌荷瘤小鼠CD8~+T细胞的增殖。