目的:本研究通过观察吗替麦考酚酯对大鼠胚胎整体发育及耳廓发育指标和对颅神经脊细胞的影响,以期建立大鼠小耳畸形动物模型,为进一步探讨小耳畸形的发病机制提供实验室基础。方法:将56只SD大鼠孕鼠随机分为4组,即对照组和MMF低、中、高3个剂量组,分别记为对照组、A组、B组、C组,每组14只。孕9-10天每天早上8点,MMF低、中、高剂量组分别用50、100、200mg/kg MMF玉米油灌胃一次,对照组用1.0ml/只玉米油灌胃一次。于孕10.5天、孕14.5天、孕20.5天脱颈处死各组孕鼠,解剖子宫取出胚胎,观察各组胚胎发育情况。1.大体指标:解剖显微镜下观察胚胎第10.5天时第一、二鳃弓的发育情况。观察胚胎第14.5天时第一、二鳃弓衍生组织的发育情况。记录胚胎第20.5天时各组胚胎总数、活胎数、死胎数、吸收胎数、活胎率,并记录各组活胎的畸形胎数、耳畸形胎数、耳畸形胎率,具体包括耳横长、耳纵长、耳纵长/耳横长、鼻枕距/双顶径、眼距、体长、体重等。观察出生后18天各组幼鼠耳廓发育情况。2.影像学检查:对第20.5天胚胎标本头颅行micro-CT检测观察中耳及内耳发育情况。3.组织学检测:取第10.5天胚胎头颅6体节前部组织行细胞视黄酸结合蛋白I(CRABP-I)免疫组化检测,观察颅神经嵴细胞改变。取第20.5天胚胎外耳标本行HE染色、甲胺蓝染色、II型胶原免疫组化,观察耳廓软骨及软组织改变。结果:1.大体指标:1.1第10.5天胚胎,对照组胚胎形态圆润饱满,第一、二鳃弓发育良好,未见融合。A组第一、二鳃弓前部融合,B组第一、二鳃弓完全融合,C组第一、二鳃弓形成团块样物质。1.2第14.5天胚胎,对照组胚胎可见耳孔、耳廓、心脏等。A组胚胎较对照组发育相似,可见耳孔、耳廓等结构。B组胚胎发育迟缓,耳廓位置异常、发育小。C组胚胎发育明显迟缓,耳廓异常、消失。1.3第20.5天胚胎,对照组孕鼠胚胎发育基本正常,各实验组随MMF剂量增加,死胎数、吸收胎数增加,活胎数及活胎率降低。各组活胎中,随MMF剂量增加,A组、B组畸形胎数、耳畸形胎数增加,C组畸形胎数、耳畸形胎数减少,耳畸形胎率各组均逐渐升高。对照组与A组相比,耳横长、耳纵长、耳纵长/耳横长、鼻枕距/双顶径、眼距、体长、体重等各指标无明显统计学差异(P>0.05)。对照组与B、C组相比,各指标存在明显统计学差异(P<0.05)。A组与B、C组相比,各指标存在明显统计学差异(P<0.05)。B组与C组相比,耳纵长、体长、体重、鼻枕距存在明显统计学差异(P<0.05),耳横长、双顶径未见明显统计学差异(P>0.05)。1.4出生后第18天幼鼠,对照组发育良好,耳廓耸立;A组发育尚可,耳廓展开,部分幼鼠耳廓圆顿;B组幼鼠仅部分存活,发育迟缓,可见耳廓发育不良;C组幼鼠出生后均逐渐死亡。2.影像学检查:第20.5天胚胎,对照组颅骨、听泡结构发育完整。A组听泡结构发育基本完整。B组听泡结构不连续。C组颅骨明显发育不良,听泡基本未发育。3.组织学检测:3.1第10.5天胚胎头颅6体节前部组织,细胞视黄酸结合蛋白I(CRABP-I)免疫组化检测。对照组可见大量褐黄色粗颗粒,呈强阳性表达。A组可见褐黄色粗颗粒,呈强阳性表达。B组胚胎可见棕黄色颗粒,呈中等阳性表达。C组胚胎可见淡黄色颗粒,呈弱阳性表达。3.2第20.5天胚胎外耳标本,HE染色、甲胺蓝染色、II型胶原免疫组化检测。3.2.1耳软骨HE染色观察:对照组与A组靠近软骨膜处软骨细胞较小,密度较高,软骨基质淡红,软骨中部细胞逐渐增大、稀疏。软骨陷窝周围基质内含大量弹性纤维。对照组软骨细胞较A组密集。B组软骨发育不良,细胞移行不明显,软骨基质减少。C组软骨发育迟缓,软骨薄,细胞排列不规则,软骨基质明显减少。3.2.2耳软骨甲苯胺蓝染色观察:对照组靠骨膜处可见软骨细胞较小,单个分布,中部软骨细胞较大、密集,软骨陷窝内同源细胞多,软骨细胞增生活跃。A组软骨与对照组相近。B组软骨细胞较前两组少,从近骨膜处至中部软骨细胞移行不明显。C组软骨细胞稀疏,排列不规则,软骨陷窝内同源细胞少,软骨增生不活跃。3.2.3耳软骨Ⅱ型胶原免疫组化观察:对照组软骨膜、软骨囊及细胞间质呈褐黄色均质状或颗粒状,呈阳性表现。靠近软骨膜、软骨囊处呈强阳性,靠近软骨中部表达逐渐减弱。A可见棕黄色颗粒,呈中等阳性表达。B组及C组可见淡黄色颗粒,呈弱阳性表达。各组II型胶原分布均匀。结论:1.吗替麦考酚酯可导致大鼠胚胎整体及耳廓组织发育不良。2.吗替麦考酚酯可能通过影响颅神经嵴细胞的迁移、增殖,进而导致大鼠小耳畸形。3.吗替麦考酚酯诱导大鼠小耳畸形动物模型,100mg/kg是比较适宜的干预剂量。