褐飞虱(Nilaparvata lugens)是一种为害水稻生产的重要农业害虫,食性单一,只能在水稻和普通野生稻上取食和繁殖后代,但繁殖速度快且繁殖量大,是我国及许多亚洲国家水稻生产上的重要害虫。本文克隆了褐飞虱DNA甲基转移酶Dnmt3的全长cDNA,进行了结构与进化分析,检测了 Dnmt3在褐飞虱整个发育阶段的表达水平。分别对Dnmt1和Dnmt3进行了 RNA干扰,发现后代数量明显减少,表明褐飞虱DNA甲基化对繁殖力具有一定的影响。此外,还对其他翅发育相关的基因进行了干扰分析。1.褐飞虱Dnmt3的全长克隆及基因结构分析从褐飞虱转录组中获得了 DNA甲基转移酶Dnvt3的基因序列片段。通过RT-PCR进行序列片段验证后,利用RACE技术获得了该基因的cDNA全长序列(GenBank登录号为KP890855)。Dnmt3基因的cDNA序列全长为2,040个碱基,包括5’非编码区的316个碱基,开放阅读框的1,230个碱基和3’非编码区的494个碱基,编码409个氨基酸。对褐飞虱Dnmt3的基因序列和蛋白序列进行了蛋白结构域、多序列比对、基因结构及系统进化树分析。结果表明,褐飞虱DNMT3只含有1个具有催化活性的DNA methylase domain,不同昆虫 DNMT3 的 DNA methylase domain 氨基酸序列相似性很高。褐飞虱DNMT3与苜蓿切叶蜂和佛罗里达弓背蚁DNMT3的相似性达到50%以上。不同物种Dnmt3基因长度相差较大,褐飞虱基因序列长度与高等膜翅目的两种蜂相近。与脊椎动物相比,昆虫外显子更长,但数量明显偏少。系统进化树分析表明,褐飞虱Dnmt3与膜翅目昆虫同源基因具有较近的进化距离。2.褐飞虱Dnmt3在不同发育阶段的表达分析对褐飞虱不同发育阶段的Dnmt3基因表达量进行了分析,检测了Dnmt3在褐飞虱1至5龄若虫、羽化24h内未产卵的长短翅雌虫、处于产卵盛期的长短翅雌虫、长短翅雄虫中表达量的变化情况。结果表明,Dnmt3的表达量在褐飞虱若虫阶段的表达量很低,而且不同龄期间的差异不明显。在成虫阶段,不同时期存在较大差异。短翅型产卵盛期雌虫表达量显著高于长翅型产卵盛期雌虫;羽化24h内未产卵的雌虫和雄虫,短翅型表达量稍高于同一时期的长翅型,但差异不明显。无论何种翅型,处于产卵盛期的雌虫表达量均高于羽化24h内未产卵的雌虫和若虫,雄虫表达量最低。为进一步明确成虫阶段的动态变化,选取1-7d不同日龄的短翅型雌虫、短翅型雄虫、长翅型雌虫和长翅型雄虫进行表达量分析。结果表明,短翅型雌虫表达量在整个成虫发育阶段,大致呈上升趋势,且表达量达到高峰的时期与产量盛期的时间大致吻合。在成虫发育阶段,短翅型雌虫表达量显著高于长翅型雌虫,雄虫的表达量最低。3.褐飞虱Dnmt1和Dnmt3的RNA干扰分析通过试剂盒体外合成Dnm3和Dnmt3的dsRNA,采用显微注射法对其进行注射干扰,从胸部背面注射处于产卵盛期的雌性短翅褐飞虱体内,注射量为200 nl,注射浓度为2,500 ng/μl,每只虫子注射量大约500ng dsRNA。每个重复30头雌虫,共三个重复。干扰注射后,30只雌虫放置于一个烧杯中,另放置20只雄性个体供交配。与对照相比,各组试虫在注射dsRNA后24h、48h、72h,Dnmt1和Dnmt3基因的表达量均显著降低,表明对这两个基因的RNA干扰都具有效果。待亲代产卵结束后,观察后代的个体数量,发现干扰Dnmt1后,后代数量极显著减少(P<0.01);而干扰Dnmt3后,后代数量显著减少(P<0.05)。研究结果表明,DNA甲基化与褐飞虱的高繁殖力具有密切的关系。4.褐飞虱翅发育相关基因的RNA干扰分析从数据库Flybase中获得与果蝇翅发育相关的3个基因Awd,Sl和Wmd,在褐飞虱基因组中进行同源搜索。根据褐飞虱这3个基因序列设计并合成相应的dsRNA,选取褐飞虱2龄若虫进行喂食干扰实验,dsRNA终浓度为200ng/μl。利用荧光定量PCR技术对干扰后不同时间点的基因表达量变化进行检测,结果表明,这3个基因被干扰后表达量均有明显降低(P<0.05),但对翅发育及翅型分化无明显的影响。