沙门氏菌在全球范围内广泛流行,血清型多达3000种以上,是最重要的食源性病原菌之一,人畜共患,可污染食品供应链的各个环节并严重威胁畜禽养殖业和公共卫生。抗生素自发明以来一直是人类对抗病原菌最有效的武器,在过去的几十年中被广泛应用甚至是滥用,随之产生的细菌耐药问题日益严重,多重耐药菌株乃至“超级细菌”的出现已经成为了世界范围内的大威胁。为了遏制耐药性的产生与发展,人们一直在不断寻找绿色有效的抗生素替代物,其中,丁酸梭菌等益生菌以其来源广、效果好、生产成本低以及安全性较高的特点备受瞩目。现有的研究已证明丁酸梭菌有提升畜禽生产性能,改善生理指标的作用,但对丁酸梭菌在肉鸡模型上拮抗肠炎沙门氏菌的作用探究尚不够全面,对丁酸梭菌发挥免疫效应的机制研究尚不够深入。因此,本研究开展丁酸梭菌对肠炎沙门氏菌感染肉鸡的保护作用及其免疫效应的探究。主要内容如下:1.丁酸梭菌拮抗肠炎沙门氏菌的作用研究选取1日龄爱拔益加(AA)肉鸡作为研究对象,探究丁酸梭菌对肠炎沙门氏菌感染肉鸡的保护作用。AA肉鸡总计240只,1日龄时随机分为4组,每组60只,包含3个重复。在整个养殖周期中,空白对照组持续饲喂基础日粮,不做其他处理;阳性对照组持续饲喂基础日粮,并于9日龄灌服肠炎沙门氏菌构建病理模型(5×10~4CFU/0.2mL);丁酸梭菌对照组在基础日粮中拌料添加丁酸梭菌(3×10~8CFU/kg)并持续饲喂;丁酸梭菌实验组在基础日粮中拌料添加丁酸梭菌(3×10~8CFU/kg),并于9日龄灌服肠炎沙门氏菌(5×10~4 CFU/0.2mL)。实验结果表明,在1~30日龄,对照组和丁酸梭菌对照组的料重比分别为1.60、1.46,沙门氏菌组为1.90,丁酸梭菌实验组为1.73。与对照组相比,丁酸梭菌对照组的料重比呈下降趋势,平均日增重(average daily gain,ADG)呈上升趋势,组间有差异但统计学不显著(P>0.05);沙门氏菌组料重比上升,而丁酸梭菌处理组料重比数据介于沙门氏菌组和对照组之间,表明丁酸梭菌可以下调肉鸡料肉比,并减轻肠炎沙门氏菌感染对肉鸡生产性能造成的影响。从组织切片结果来看,空白对照组和丁酸梭菌对照组都表现出了完整的肠绒毛结构,均未出现明显的肠绒毛结构损伤现象;沙门氏菌组局部肠绒毛出现明显断裂现象,而丁酸梭菌实验组的肠上皮结构相对较完整,表明丁酸梭菌对肠道组织的完整性有保护作用。与对照组相比,丁酸梭菌实验组中肉鸡对新城疫(ND)疫苗所诱发的HI抗体滴度提高(P>0.05),沙门氏菌组ND和H9亚型禽流感(AI-H9)的抗体滴度水平降低,丁酸梭菌处理组的抗体效价比沙门氏菌组高。说明丁酸梭菌可促进机体免疫新城疫疫苗后的免疫反应,从而提高ND和AI-H9的抗体水平。30日龄肉鸡的各处理组血清中IgA含量无明显差异,IL-1β较对照组呈下降趋势;丁酸梭菌对照组比阴性对照Control组、丁酸梭菌实验组比沙门氏菌组中的IL-8都呈下降趋势,表明丁酸梭菌有降低肉鸡血清IL-8的作用。丁酸梭菌对照组比空白对照组、丁酸梭菌实验组比沙门氏菌组中的IFN-γ都呈下降趋势,表明丁酸梭菌有降低肉鸡血清IFN-γ的作用。在试验第30天,各日粮处理组肠道菌群α-多样性Shannon指数差异不显著(P>0.05),丁酸梭菌组Simpson指数显著低于对照组(P<0.05),表明丁酸梭菌可以调节肠道菌群结构,建立稳定健康肠道菌群。各日粮处理组之间菌群丰富度指数ACE指数和Chao 1指数差异不显著(P>0.05)。本研究结果表明,丁酸梭菌可对肠炎沙门氏菌感染肉鸡起到保护作用,未来有潜力作为抗生素替代品之一,用于拮抗畜禽养殖业中的肠炎沙门氏菌感染。2.丁酸梭菌免疫效应机制以3周龄C57品系小鼠作为研究对象,探究丁酸梭菌对健康机体的免疫效应。试验期间选用36只3周龄健康C57小鼠,将小鼠随机分为四组,每组9只,各分3笼。分组情况如下:空白对照组中每只小鼠饲喂普通饮食和普通饮水;丁酸钠对照组中每只小鼠饲喂普通饮食,在饮水中加入0.1g/mL丁酸钠;低浓度丁酸梭菌组,每只小鼠饲喂普通饮食,在每毫升饮水中加入1×10~7 CFU的丁酸梭菌;高浓度丁酸梭菌组,每只小鼠饲喂普通饮食,在每毫升饮水中加入1×10~9 CFU的丁酸梭菌。饲养3周龄后,采集血清和盲肠内容物检测各短链脂肪酸的含量以及肠道微生物的多样性,采集脾脏和皮下脂肪组织制备单细胞悬液并做流式细胞术检测。结果表明,丁酸钠组中乙酸(P<0.05)、丙酸、丁酸以及戊酸(P<0.05)的浓度均有上调趋势,但个体差异较大;各浓度丁酸梭菌组中乙酸浓度上调,其中低浓度丁酸梭菌组的趋势更明显。流式细胞术结果表明脾脏淋巴细胞中丁酸钠以及丁酸梭菌处理组中CD4+/CD8+的比值呈下降趋势(P>0.05),而皮下脂肪组织细胞中CD4+/CD8+的比值在丁酸钠和高浓度丁酸梭菌组中上调,在低浓度丁酸梭菌组中未有明显变化在丁酸梭菌实验组皮下脂肪组织细胞中的Tregs数量增多,说明饲喂丁酸梭菌可以促进Tregs在皮下脂肪组织中累积,进而调控机体的各项生理指标,对丁酸梭菌调节机体肥胖和脂肪炎症有启示作用。本研究利用16S rRNA高通量测序技术分析小鼠肠道内容物中微生物菌群的特性。在Class纲分类水平上,饲喂丁酸梭菌和丁酸钠均降低了拟杆菌的丰度,提升了疣微菌的丰度,丁酸梭菌还提升了弯曲菌和脱硫弧菌的丰度。在Family科水平上,丁酸梭菌和丁酸钠处理均降低了S24-7的丰度,丁酸梭菌提升了螺杆菌的丰度。结合Metastat分析,发现在某些特定细菌的相对丰度上,丁酸钠组和低浓度丁酸梭菌组较空白对照组趋势基本一致,例如:丁酸梭菌组和丁酸钠组中拟杆菌Bacteroides、厌氧棍状菌Anaerotruncus、普雷沃氏菌Prevotella以及乳杆菌Lactobacillus的相对丰度较空白对照组增多,脱硫弧菌Desulfovibrio的相对丰度降低。上述结果表明饮水摄入丁酸钠和丁酸梭菌后,小鼠的肠道菌群构成发生了类似的变化,表明丁酸可能是丁酸梭菌发挥免疫效应的效应分子之一。而经过KEGG功能注释,观察组间有差异的KEGG第二等级功能类群的相对丰度,发现丁酸梭菌组反而与空白对照组表规律较为一致,而丁酸钠组则展现出了不同的丰度:核酸代谢和碳水化合物代谢相关功能群丰度降低,异形生物质降解代谢以及萜和聚酮代谢相关功能群丰度升高。结合菌群结构和功能注释的结构,推测丁酸梭菌作为一种可以定殖在肠道中的活菌,可能会与更多菌发生关联互作,经由更多途径和通路发挥益生作用。综上所述,丁酸梭菌可对肠炎沙门氏菌感染肉鸡起到保护作用,可促进健康小鼠的免疫功能,发挥免疫效应,为丁酸梭菌拮抗病原菌以及实现减少抗生素在养殖中的使用提供了重要的理论依据。