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在真核细胞体内,蛋白质的合成与降解是维持正常细胞功能的重要手段,细胞内蛋白质的降解主要是通过泛素-蛋白酶体系统来完成,它能快速的将细胞内异常蛋白和短暂时期内控制细胞生命活动的调节蛋白所降解,在多种细胞功能的调节中起着重要作用。由于泛素连接酶E3具有对底物蛋白识别的特异性及负责将泛素分子转至底物的功能,因此成为这一系统中最复杂的酶类家族,而SCF(Skp1-Cul1-F-Box)复合体则是其中最大,研究最多的一组。小球藻病毒模式株PBCV-1(Paramecium bursaria chlorella virus-1),基因组测序结果显示它同时编码F-Box和Skp1蛋白,而其宿主小球藻Chlorella variablis基因组也已全长测序,因此小球藻病毒侵染宿主过程是研究病毒-宿主蛋白相互作用的重要试验体系。本研究运用酵母双杂交技术和哺乳动物细胞异源表达方法进行病毒-宿主间蛋白相互作用的研究,并利用pull-down技术筛选与小球藻病毒Skp1互作的宿主细胞蛋白,旨在深入了解小球藻病毒E3连接酶介导的病毒宿主相互作用机制。本研究不仅为阐明小球藻病毒E3组分与宿主之间存在蛋白互作提供重要理论依据,还为建立一种有病毒参与主导的病毒-细胞混合型SCF复合物提供可能性,从而进一步完善真核细胞内蛋白降解的泛素-蛋白酶体途径。本研究通过实验室提供的5种F-Box蛋白基因进行酵母密码子优化,以优化后片段为模板,进行基因全长扩增,并将其插入pGBKT7载体,构建pGBKT7-F-Box诱饵质粒,使用同种方法将2种Skp1蛋白基因插入pGADT7载体,构建pGADT7-Skp1猎物质粒。采用Gold Yest Two-Hybrid System系统将诱饵质粒转进Y2HGold酵母菌进行了毒性,自激活验证试验,结果显示F-Box片段的插入对酵母菌的生长没有毒性及自激活作用。把得到的两种质粒共转化进Y2HGold酵母菌中进行了AbAr,HIS3,MEL1三种报告基因的检测,转化进Y187酵母菌进行了LacZ报告基因的检测。结果显示5种FBox蛋白与2种Skp1蛋白均有相互作用,且作用强弱存在差异。本实验运用哺乳动物细胞异源表达方法继续进行小球藻病毒Skp1与宿主SCF组分相互作用进行研究。试图建立一种可能有病毒参与主导的病毒-细胞混合型SCF复合物完整模型。选取小球藻病毒Skp1,人源Skp1通过基因合成将其与GST标签蛋白融合,病毒F-box A682L,人源F-box Skp2通过基因合成将其与Flag标签蛋白融合,插入真核表达载体pcDNA3.1(-),将两种Skp1分别与不同的F-box共转染进293T细胞,利用磁珠法免疫共沉淀技术得到的目的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot检测,结果显示2种Skp1蛋白与2种F-box蛋白之间均存在相互作用。为建立一种有病毒参与主导的病毒-细胞混合型SCF复合物提供可能性。本实验室通过将PBCV-1的Skp1蛋白基因片段扩增,插入表达载体pEGX-6P-1上,表达出可溶性蛋白,将其结合到Sepharose 4B树脂上与被感染的小球藻NC64A细胞裂解液进行Pulldown实验,银染结果进行质谱分析。结果显示筛选出19种与小球藻NC64A有关的亲和蛋白。本研究结果有利于实验室进一步构建病毒-细胞混合型SCF泛素连接酶复合体模型,同时还为挖掘小球藻病毒与宿主E3组分之间存在的蛋白相互作用及其潜在功能提供理论依据。