一、文献综述炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）分为溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）及克罗恩病（crohn’s disease,CD）,本章主要阐述肠道菌群失衡与IBD发生发展之间的关系,分析了 IBD的致病因素,归纳了 IBD宿主体内肠道菌群组成的变化并分析了菌群紊乱的原因。总结了目前通过调控肠道菌群组成改善炎症性肠病的策略。介绍了传统中药黄蜀葵花（Flos Abelmoschusmanihot,AM）的药理作用并总结了黄蜀葵花应用于治疗UC及CD的研究进展,为黄蜀葵花改善IBD提供理论基础。二、黄蜀葵花总提物对不同炎症性肠病模型小鼠肠道炎症、黏液屏障及菌群稳态的作用评价葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium,DSS）诱导的急性、慢性IBD模型及IL-10-/-模型是目前研究IBD中最常用的三种模型。IBD模型小鼠通常表现为体内炎症水平升高,肠道组织受损、黏液层变薄及肠道菌群紊乱。其中黏液层主要由黏蛋白2（Muc2）组成,而Muc2则由杯状细胞合成分泌。本章主要基于以上三种模型,评价黄蜀葵花总提物对IBD模型小鼠的作用。使用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA）检测体内炎症因子水平;使用聚合酶链式反应（PCR）检测结肠组织Muc2的转录水平;使用病理染色方法检测结肠组织病变等。实验结果发现黄蜀葵花总提物可改善急性IBD小鼠体重、降低疾病活动指数（DAI）评分、恢复结肠长度,并促进IL-10的分泌;同时也可显著改善小鼠近端结肠组织炎性浸润,恢复杯状细胞数量。以上结果提示,黄蜀葵花总提物可显著改善急性IBD小鼠结肠炎症及黏液屏障。急性IBD小鼠类似临床病人的发作期。IBD是一种慢性疾病,反复发作。为了进一步模拟IBD临床表现,建立了 DSS诱导的慢性IBD模型,并探讨黄蜀葵花总提物的保护作用。结果发现,黄蜀葵花总提物依旧可以恢复慢性IBD小鼠体重、降低DAI评分、增加结肠长度,升高小鼠血液中IL-10的水平。同时,对近端结肠组织炎性浸润具有一定改善的趋势,并显著恢复近端结肠杯状细胞数量。以上结果表明,黄蜀葵花总提物可一定程度上改善慢性IBD小鼠结肠炎症及黏液屏障。而且发现黄蜀葵花总提物无论是对急性IBD模型还是慢性IBD模型,均能促进IL-10分泌,提示黄蜀葵花总提物改善IBD可能与促进IL-10分泌有关。为了进一步研究黄蜀葵花总提物改善IBD小鼠是否通过IL-10发挥作用,使用IL-10-/-小鼠进行药效评价,而IL-10-/-小鼠也是一种自发慢性IBD小鼠的模型。结果发现IL-10-/-小鼠近端结肠表现出隐窝增长、黏膜下层增厚及黏液屏障受损,而黄蜀葵花总提物失去了改善的作用。IL-10-/-小鼠远端结肠及直肠出现明显的炎性浸润及杯状细胞丢失,且伴随着小肠增长、盲肠膨胀,但黄蜀葵花总提物均无改善作用。这些结果表明,黄蜀葵花总提物改善IBD小鼠结直肠炎症及黏液屏障均依赖IL-10。肠道菌群的紊乱与IBD的进展密切相关。为了研究黄蜀葵花总提物是否可改善IBD小鼠紊乱的肠道菌群,使用16S rRNA测序技术,对三种模型小鼠的粪便进行肠道菌群测序。结果发现,在三种模型中,不同细菌呈现出不同的变化趋势。Akkermansiaceae的丰度在急性IBD小鼠中降低,但在两种慢性IBD小鼠中增加。Muribaculaceae的丰度在急性IBD小鼠中增加,但在两种慢性IBD小鼠中降低。Bifidobacteriaceae的丰度在急性IBD小鼠和IL-10-/-小鼠中降低,在DSS诱导的慢性IBD小鼠中增加。Peptostreptococcaceae的丰度在DSS诱导的急性IBD和慢性IBD小鼠中增加,但在IL-10-/-小鼠中减少。虽然在这三种IBD模型小鼠中四类细菌的变化不一致,但黄蜀葵花总提物可以调控Akkermansiaceae、Muribaculaceae、Bifidobacteriaceae 和 Peptostreptococcaceae 的稳态,使这四类细菌从 IBD时的紊乱状态向健康宿主的状态转化。三、黄蜀葵花醇提物以及多糖对炎症性肠病模型小鼠的肠道炎症、黏液屏障及菌群稳态的作用比较黄蜀葵花含有丰富的黄酮类脂溶性成分及多糖类物质。前期研究中,黄蜀葵花总提物由黄蜀葵花醇提物及多糖构成。前述研究发现黄蜀葵花总提物可以改善IBD,本章在此基础上,研究黄蜀葵花总提物中发挥改善IBD的作用成分。使用DSS诱导的急性IBD小鼠,并通过PCR技术检测炎症因子转录水平、病理染色方法检测组织病变及16S rRNA测序技术分析菌群变化。结果发现黄蜀葵花醇提物及黄蜀葵花多糖均可改善急性IBD小鼠结肠炎,但两者作用特点不同。与黄蜀葵花多糖相比,黄蜀葵花醇提物在小鼠体重、DAI评分、结肠长度、粪便含水量等方面表现出更强的改善作用,而且在IL-10水平及结肠组织炎性浸润等方面表现出更强的作用。然而,在恢复小鼠结肠杯状细胞及黏液层厚度等方面,黄蜀葵花多糖的作用强于黄蜀葵花醇提物。在菌群调控中,16S rRNA测序结果表明,黄蜀葵花醇提物主要调控厚壁菌门中的毛螺菌科（Lachnospiraceae）细菌,黄蜀葵花多糖则主要调控疣微菌门中Akkermansiaceae科细菌的丰度。以上结果表明,黄蜀葵花醇提物及黄蜀葵花多糖虽均可改善急性IBD小鼠结肠炎症及黏液屏障,但黄蜀葵花醇提物具有更强的抗炎作用,且主要调控毛螺菌科细菌;而黄蜀葵花多糖则具有更强的黏液修复作用,且主要调控Akkermansiaceae 科细菌。四、黄蜀葵花醇提物调控肠道菌群平衡促进IL-10分泌改善肠道炎症的作用机制研究前述研究发现黄蜀葵花醇提物具有较强的抗炎作用,因此本章选择黄蜀葵花醇提物进行进一步的机制研究。首先使用DSS诱导的急性IBD小鼠模型,探讨不同剂量的黄蜀葵花醇提物对急性IBD小鼠的作用。结果发现黄蜀葵花醇提物促进小鼠结肠组织IL-10 mRNA表达、改善结肠炎性浸润、恢复杯状细胞数量及增加黏液层厚度,且均呈剂量依赖性。同时发现黄蜀葵花醇提物可呈剂量依赖性促进毛螺菌科细菌生长。由于黄蜀葵花总提物改善结肠炎依赖于IL-10,那么黄蜀葵花醇提物改善结肠炎是否也依赖IL-10?为了研究IL-10在黄蜀葵花醇提物改善结肠炎中的作用,使用IL-10-/-小鼠并给予黄蜀葵花醇提物进行治疗。结果发现黄蜀葵花醇提物无法改善小鼠结肠炎症及黏液屏障。由此可知,黄蜀葵花醇提物改善IBD小鼠结肠炎的作用依赖IL-10。毛螺菌科细菌被认为是IBD的有益菌。文献研究发现,毛螺菌科细菌可通过分解膳食纤维产生有益代谢物丁酸,丁酸被报道可促进IL-10的分泌。为了研究毛螺菌科是否是黄蜀葵花醇提物促进IL-10分泌的关键细菌,接下来使用盐酸万古霉素清除小鼠体内毛螺菌科细菌,并使用DSS诱导小鼠急性结肠炎。结果发现缺失毛螺菌科后,黄蜀葵花醇提物无法促进急性IBD小鼠结肠组织IL-10 mRNA表达。此结果表明,黄蜀葵花醇提物促进IL-10 mRNA表达的作用依赖于毛螺菌科,毛螺菌科是黄蜀葵花醇提物促进IL-10分泌的关键细菌。通过深入的文献研究发现,在IBD宿主中,毛螺菌科介导的菌群平衡有益于结肠炎的改善。肠杆菌科异常增殖是导致免疫稳态失衡并加剧肠道炎症的重要诱因。本实验发现毛螺菌科细菌的丰度与肠杆菌科呈负相关,并且黄蜀葵花醇提物可调控毛螺菌科与肠杆菌科平衡。为了探讨黄蜀葵花醇提物是否直接促进毛螺菌科细菌生长,我们构建体外粪便混合菌培养体系。给予不同剂量的黄蜀葵花醇提物,在有氧及无氧环境下培养至相应时间。结果发现黄蜀葵花醇提物在有氧环境下可呈剂量依赖性促进粪便混合菌中毛螺菌科细菌的生长。为了观察黄蜀葵花醇提物对肠杆菌科细菌的直接作用,我们构建了肠杆菌科模式细菌-大肠杆菌的单菌培养体系。发现无论处于无氧或者有氧状态,黄蜀葵花醇提物均不影响大肠杆菌细菌的生长。以上结果表明:黄蜀葵花醇提物可直接促进毛螺菌科细菌生长,而不直接抑制肠杆菌科细菌生长;推测黄蜀葵花醇提物可能通过促进毛螺菌科细菌生长从而抑制肠杆菌科细菌增殖。为了验证上述推测,构建了体内钨酸盐及盐酸万古霉素清菌实验。钨酸盐被报道可靶向清除肠杆菌科细菌,然而在本实验中发现钨酸盐仅在给予葡聚糖硫酸钠时期抑制肠杆菌科生长;在停止使用葡聚糖硫酸钠后,钨酸盐反而促进肠杆菌科生长。在钨酸盐促进肠杆菌科生长的情况下,进一步使用盐酸万古霉素清除毛螺菌科,发现肠杆菌科细菌增殖更为异常。此结果表明,毛螺菌科细菌可直接抑制肠杆菌科细菌的增殖。以上结果表明,黄蜀葵花醇提物可通过促进毛螺菌科生长刺激IL-10分泌及抑制肠杆菌科增殖。为了研究黄蜀葵花醇提物促进IL-10分泌与肠杆菌科细菌之间是否存在关系,使用钨酸盐添加在IBD小鼠饮水中。结果发现,当黄蜀葵花醇提物抑制肠杆菌科生长时,黄蜀葵花醇提物可促进IL-10分泌;然而当黄蜀葵花醇提物无法抑制肠杆菌科生长时,黄蜀葵花醇提物则无法促进IL-10分泌。此结果表明,黄蜀葵花醇提物对IL-10的作用依赖于对肠杆菌科的调控。总而言之,在肠道炎症期间,黄蜀葵花醇提物通过促进IL-10分泌改善结肠炎;而且促进IL-10分泌的作用依赖于黄蜀葵花醇提物对毛螺菌科及肠杆菌科的调控。为了验证上述结果,在非肠道炎症时,使用健康野生型小鼠直接给予黄蜀葵花醇提物,观察其对小鼠体内IL-10水平、毛螺菌科及肠杆菌科丰度的作用。发现在健康小鼠中,与模型小鼠结果一致,黄蜀葵花醇提物同样可以促进毛螺菌科生长,并且抑制肠杆菌科增殖;同时促进小鼠结肠组织IL-10 mRNA的表达。当在健康小鼠的饮水中添加盐酸万古霉素,清除毛螺菌科细菌后,与模型小鼠体内结果一致,黄蜀葵花醇提物失去了促进结肠组织IL-10 mRNA表达的作用;且也无法抑制过度增殖的肠杆菌科。此结果再次证明上述结果:黄蜀葵花醇提物对肠杆菌科及IL-10的调控作用均依赖于毛螺菌科。综上所述,本研究发现黄蜀葵花总提物可改善急性及慢性IBD小鼠的结肠炎;但在IL-10-/-小鼠中,黄蜀葵花总提物则丧失改善结肠炎的作用;表明黄蜀葵花总提物改善IBD小鼠结肠炎的作用依赖于IL-10。对三种模型小鼠的菌群进行分析发现,黄蜀葵花总提物可以调控 Akkermansiaceae、Muribaculaceae、Bifidobacteriaceae 和 Peptostreptococcaceae 的稳态。黄蜀葵花总提物主要由醇提物及多糖组成。研究发现,黄蜀葵花醇提物及多糖均可改善IBD,但黄蜀葵花醇提物具有更强的抗炎作用,且主要调控毛螺菌科细菌;而黄蜀葵花多糖具有更强的黏液修复作用,且主要调控Akkermansiaceae细菌。本课题选择抗炎作用更强的黄蜀葵花醇提物进行深入机制研究,发现无论处于肠道炎症或非肠道炎症时,黄蜀葵花醇提物均通过促进毛螺菌科细菌生长抑制肠杆菌科细菌增殖,从而促进IL-10的分泌,最终有益于保护肠道组织。