论文部分内容阅读
我国葡萄面积达1 080余万亩,居世界第二位。葡萄病毒病发生普遍,严重影响葡萄产量和品质。葡萄蚕豆萎蔫病毒(grapevine fabavirus,GFabV)是2016年新报道的葡萄病毒,普遍发生于各个葡萄产区。本研究针对GFabV分子检测方法欠缺、危害性不清等问题,扩增获得了我国首个GFabV全基因组序列,在此基础上,建立了高灵敏的荧光定量PCR检测技术,并初步明确了GFab V对葡萄的危害性,主要结果如下:采用小RNA测序方法从‘香妃’葡萄中鉴定出GFabV,并通过PCR和RACE方法扩增获得GFabV XF分离株基因组RNA1和RNA2的完整核苷酸序列。XF分离株基因组RNA1和RNA2的大小分别为5 822和3 134个核苷酸(nt),与其他GFabV分离物同源性进行比对,结果表明,RNA1的核苷酸(nt)和氨基酸(aa)同源性分别为81.7?82.8%和92.0?94.2%,RNA2分别为76.4?82.8%和89.2?96.1%。对国内外GFabV分离物序列进行系统进化分析,显示XF形成一个独立的进化分支。此外,分析了来源于GFabV小干扰RNA(vsiRNA)的长度及在基因组的分布情况,结果显示,大多数vsiRNA的长度为16-23 nt,并沿基因组对称分布,在RNA1和RNA2中均存在多个vsiRNA产生热点。本研究为关于GFabV完整基因组的首次报道。根据GFabV分离物基因组序列的保守区域设计引物,建立了GFabV的实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测技术。该技术标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系(扩增效率103.8%,相关系数0.998),灵敏度是常规RT-PCR的1 000倍,并具有特异性。采用RT-q PCR和常规RT-PCR方法对葡萄不同发育时期及不同部位的316个样品进行检测,结果表明RT-qPCR方法的检出率(96.8%)明显高于RT-PCR(70.8%)。RT-qPCR对休眠枝条的检出率达100%,对其他部位样品的检出率均在92%以上,明显高于RT-PCR(42%~97%)。各个发育时期内的RT-qPCR检出率(85%~95%)也普遍高于RT-PCR(70%~90%)。该技术对于田间样品的检测适用范围广,明显优越于常规RT-PCR方法。本研究以感染和未感染GFabV的‘夏黑’、‘巨峰’和‘品丽珠’葡萄品种为试材,对其农艺性状、果实品质以及植株叶片的光合作用率(Pn)、蒸腾速率(E)、气孔导度(Gs)及气孔CO2浓度(Ci)变化情况进行测定和分析。结果表明,GFabV的侵染减小了果实的单果重量、浆果尺寸和可溶性固形物含量,增加了可滴定酸的含量。受GFabV感染的‘夏黑’、‘巨峰’和‘品丽珠’葡萄植株中的光合作用率、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率均显著降低,其中,‘夏黑’和‘品丽珠’两个品种的光合作用率下降最为显著。在农艺性状测定上,‘巨峰’葡萄枝条的粗度、枝条的长度和枝条的重量与对照相比,显著下降。此外,对感染和未感染GFabV的‘夏黑’葡萄进行转录组分析,结果表明在植物病原体互作、类黄酮生物合成等途径的基因明显上调。